铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

黄 鑫，师凯辉，胡 凇，田英男，冯 垒，韩欣妤，孙 博，王义琴，王冬梅，何 玲, 朱永平，和凤美

(云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201)

MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，在植物生长发育和信号传导过程中起着重要的作用。SEP类基因作为参与调控植物生长发育功能的一类基因，也属于MADS-box基因的一员。一开始，学者们对关于花器官形成的研究，总结出了经典的ABC模型，换而言之，就是花器官的形成主要与A、B和C 3类功能基因相关，而随着SEP类基因功能的揭示，ABC模型升级为ABCE模型，即每一轮花器官的发育都需要E类基因的参与，而E类基因中的SEP1/2/3是研究者在拟南芥中发现的，并且可以与ABCE 4类功能基因一起参与花器官的发育和调控。目前研究者研究了拟南芥（Arabidopsis thaliana）、桃（Amygdalus persica）、金钗石斛（Dendrobium nobile）、芦笋（Asparagus officinalis）和绿竹（Dendrocalamopsis oldhami）等植物中SEP3基因的表达和相关功能[6-10]。

铁皮石斛是兰科石斛属多年生草本植物，其不仅仅具有很高的药用价值，同时还具有一定的观赏价值，然而由于铁皮石斛繁殖难、种植难、品种单一，野生资源因过度采挖而逐渐枯竭，市场品质良莠不齐，加上育种目标不明确、育种技术研究滞后等，导致铁皮石斛产业发展缓慢[11]。因此，对培育铁皮石斛优质新品种具有重大意义。

目前对与铁皮石斛的研究主要集中于其药理分析、快繁体系等方面，而有关花型发育方面的研究几乎没有。本研究通过对铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及利用 CRISPR/Cas9技术构建出铁皮石斛的SEP3敲除载体并进行了遗传转化，以期为进一步研究SEP3基因在铁皮石斛花朵发育中的功能及创造优质品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物信息学数据 铁皮石斛DoSEP3基因序列来源于铁皮石斛转录组NR注释中的SEP3基因，根据FPKM（Fragments per kilobase per million）值选择了表达量较高的序列，基因比对及构建系统发育树所需其他物种氨基酸序列来源于uniprot数据库。

1.1.2 菌株及质粒 载体构建所需的Cas9骨架载体Ubi-H及启动子质粒pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6-b和pYLsgRNA-OsU6c由华南农业大学刘耀光教授惠赠，实验所用的大肠杆菌为TOP10，农杆菌为EHA105。

1.1.3 植物及试剂 实验用于转化的铁皮石斛为种子萌发所得的铁皮石斛原球茎。T5 Direct PCR Kit直接PCR扩增试剂盒购自擎科生物公司。

1.2 方法

1.2.1DoSEP3蛋白生物信息学分析 核苷酸翻译使用DNAMAN软件，采用Clustalx，MEGA6.0软件进行氨基酸序列比对和系统发育树的构建，利用ProtParam在线工具对其编码蛋白进行预测和分析，利用SOPMA在线工具预测蛋白质二级结构，利用Swiss-model在线工具预测蛋白质三级结构，利用TMHMM在线工具进行跨膜区域分析，利用PSORT Prediction在线工具预测亚细胞定位。

1.2.2 铁皮石斛SEP3基因敲除载体构建 使用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)进行靶点设计[12]，并依据设计的靶点设计了3个sgRNA表达盒引物（表1），作为载体构建方法依据[13]。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.3 遗传转化铁皮石斛原球茎及阳性原球茎的检测 将构建好的敲除载体热激转入EHA105农杆菌，参照前人利用农杆菌遗传转化铁皮石斛的方法[17]，经过抗性筛选后，切取小块原球茎并利用特异性引物cas-f/cas-r(表1)进行直接PCR验证获得转基因铁皮石斛阳性原球茎。

2 结果与分析

2.1 DoSEP3基因的核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列

铁皮石斛DoSEP3基因CDS序列长度为354 bp，使用DNAMAN软件预测，预测编码117个氨基酸（图1）。

图1 铁皮石斛DoSEP3基因的核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列Figure 1 Nucleotide sequence of Dendrobium officinale DoSEP3 gene and its encoded protein amino acid sequence

2.2 DoSEP3蛋白理化性质分析

利用ProtParam分析结果显示，其分子式为C 599 H 978 N178 O 160 S7。相对分子质量为13 457.87 Da，半衰期为30 h，不稳定系数为60.53，而不稳定系数小于40为稳定蛋白，所以该蛋白为不稳定蛋白，理论等电点为10.04，带负电荷的残基总数（Asp + Glu）为12，带正电荷的残基总数（Arg +Lys）为23，脂肪指数为 94.10，亲水性的平均值为—0.121，属于亲水蛋白。

2.3 DoSEP3蛋白二级结构和三级结构的预测

利用SOPMA在线预测蛋白质二级结构（图2），其中α-螺旋结构占50.05%，延伸链占20.28%，β-转角占11.89%，无规则卷曲占17.78%，其中大部分氨基酸处于α-螺旋结构。在此基础之上，利用Swiss-model预测其三级结构模型（图3），其GMQE值为0.22，QMEAN值为–1.05，零附近的QMEAN值表明模型结构与相似大小的实验结构之间具有良好的一致性。分数为–4.0或以下表示模型的质量较低[14]。

图2 蛋白质二级结构预测图Figure 2 Predicted map of the protein secondary structure

图3 蛋白质三级结构模型Figure 3 Tertiary structure model of the protein

2.4 系统进化树构建及多序列比对

利用Clustalx，MEGA6.0软件构建简单系统发育树（图4），可以看出DoSEP3与同为兰科石斛属的金钗石斛的亲缘关系最近。然后再取亲缘关系较近的几个物种进行氨基酸序列比对（图5），蓝色较多的部分占比较大，由此可以看出氨基酸序列的一致性和相似性较高。

图4 DoSEP3蛋白与其他物种SEP3蛋白的系统进化树分析Figure 4 DoSEP3 evolutionary tree analysis protein systems in other species

图5 DoSEP3与其他物种SEP3氨基酸序列比对Figure 5 DoSEP3 alignment of amino acid sequences with SEP3 from other species

2.5 DoSEP3亚细胞定位，跨膜区预测

利用TMHMM在线进行跨膜区域分析（图6），可以看出该蛋白具有一个跨膜区，利用PSORT Prediction在线预测亚细胞定位，其中内质网和细胞核定位得分较高，说明该蛋白作用可能定位于内质网或细胞核。

图6 DoSEP3跨膜区域分析Figure 6 DoSEP3 transmembrane region analysis

2.6 DoSEP3基因敲除载体构建

利用获得第一轮PCR的产物（图7），再用第一轮PCR产物进行第二轮PCR组装，获得预期大小的3个sgRNA表达盒(图8)；采用金门克隆法将多个sgRNA表达盒串联连接到骨架载体上，导入大肠杆菌DH10B感受态细胞，使用菌落PCR进行阳性菌落筛选（图9）。随后平板划线，挑菌摇菌可参考之前生物信息学分析中的半衰期，提取质粒，并用载体上的引物SP-L1和SP-R进行测序，测序结果表明构建的靶位点sgRNA及启动子均在载体上。由此说明SEP3基因的敲除载体构建完成，可用于后续的遗传转化研究。

图7 第一轮PCR产物Figure 7 The first round PCR product

图8 第二轮PCR产物Figure 8 The second round PCR product

图9 大肠杆菌菌落PCR产物Figure 9 Escherichia coli colony PCR product

2.7 阳性铁皮石斛原球茎的鉴定

选择8颗经过抗性筛选后的原球茎切取小块后，使用载体上的特异性引物，利用直接PCR扩增试剂盒进行PCR阳性检测(图10)。编号1、3、4、5和6为阳性原球茎。

图10 特异性引物PCR产物Figure 10 PCR product using specific primers

3 讨论与结论

多年来，研究者们对于SEP类基因的研究主要集中于拟南芥、水稻等经典植物上，而对于石斛兰SEP类基因的研究报道较少。通过生物信息学分析，可以预测SEP类基因在植物生长发育过程中的作用原理，预测SEP类基因的进化机制，由此可以减轻试验的工作量，也增强了试验的目的性。基于系统发育树的构建，可以通过已知基因功能的植物去推测同一分支不同植物相同基因的功能。已知SEP类基因在植物花器官的分化和发育中起着非常重要的作用。前人的研究也表明SEP3基因在花器官中的表达量远大于其在茎、叶中的表达[15]。SEP3基因在金钗石斛春化过程中的转录发生变化，可能与成花转变有关蛋白的抑制和后续促进花器官生长有关[8]，SEP3可能通过与开花促进因子OC1发生相互作用而对成花转变过程进行调控[16]。由此可以推测，SEP3基因也作用于铁皮石斛的花器官发育过程，而SEP3基因作为MADS-box家族中参与花开调控基因的一员，对其展开研究有助于更好地了解其调控机理。

CRISPR/Cas9系统是最新的第3代基因编辑技术，已广泛地运用于细菌和动物中。随着技术的不断成熟，关于该系统在植物中的验证和应用的报道很多，但在兰科植物中的应用较少，兰科植物是被子植物第二大科，拥有达尔文花之称，是研究物种进化的最好材料[17]。

本研究通过对铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析，了解了DoSEP3蛋白的理化性质，确定了该蛋白为不稳定的亲水蛋白。蛋白质二级结构和三级结构的预测质量也较高，根据系统发育树和氨基酸序列的比对，可以推测DoSEP3的作用与同为兰科石斛属的金钗石斛中SEP3基因作用相似，DoSEP3主要分布于内质网和细胞核，且具有一个跨膜结构域，推测可能通过细胞核和内质网参与花器官发育。利用CRISPR/Cas9技术构建出了敲除载体并进行了遗传转化试验，且成功将载体导入原球茎中，获得了铁皮石斛阳性原球茎，这为了解MADS-box家族中SEP类基因在花发育过程中的所起的作用奠定了基础，为进一步研究SEP3基因在铁皮石斛花器官发育中的功能及创造优质品种提供帮助。