60Co-γ辐射对广适性水稻品种绥粳18的诱变影响

刘宝海，刘 晴，聂守军，刘宝民，付立新，王明泉，高世伟，刘宇强，常汇琳，张佳柠，马 成，薛英会，白 瑞，王洪彬，唐 铭，门龙南

(1. 黑龙江省农业科学院绥化分院，绥化 152052; 2.黑龙江省农业科学院玉米研究所，哈尔滨 150086;3. 黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319)

中国是世界上最大水稻生产国[1]，稻米是中国约65%人口的主食[2]。水稻作为黑龙江省主要粮食作物，2017年种植460多万hm2，约占全国粳稻种植面积50%以上[3]，新品种选育为黑龙江水稻单产提高、总产持续增加和综合生产能力稳定提升做出了突出贡献[4]，对保障国家粮食安全生产和国计民生意义重大[5-6]。水稻品种绥粳18，2014年1月通过黑龙江省农作物品种审定委员会审定，具有早熟、优质、高产、稳产、耐冷、抗病和抗倒伏等优良特性[7]，种植推广适应性极强，2017—2019年在黑龙江省种植面积连续达到67万hm2以上，已成为黑龙江省第二、三积温带主裁品种，是全国种植面积最大粳稻品种[8]。然而，根据以往黑龙江省大面积推广品种的种植经验来看，随着种植年限延长，会出现抗病性和抗倒伏性逐渐弱化现象，存在对水稻安全生产造成不良影响的潜在风险，同时生产实践对产量和品质等遗传累加有增效的新品种需求也较迫切，目前绥粳18种植面积较大而导致适应区内主裁品种单一和后备品种储备不足的情况日益突显。因此，以水稻生产安全且品种有益遗传增效需求为索引，探索实用高效的育种途径，立足替代或超越水稻品种绥粳18的育种目标，快速选育储备出能够遗传绥粳18广适性状且综合农艺性状优良的水稻新品种是非常必要的。

1928年，美国科学家Stadler最早进行辐射诱变育种[9]。中国辐射诱变育种研究始于1957年，起步较晚，但发展迅速[10]，截至2016年育成品种已占国际品种总数1/4强[11]。γ射线能量高、穿透力强，可以造成共价键断裂，诱导DNA产生大片段缺失有效，最终导致植株性状发生变异[12-13]。60Co-γ射线作为诱发源引入辐射育种，具有诱变突变率高、稳定性好、育种周期短和可扩展遗传基础等优点，是目前最常用辐射诱变源[14-15]，相比利用育种周期长和创造突变新变异类型有限的常规杂交方法[16]来讲，辐射诱变水稻材料将是一个快速获得多种突变新种质的有效方法[17]。在育种实践中射诱变水稻培育新品种和创制种质新资源的成果最突出[18]。浙江省2000—2015年间利用辐射诱变育成245个，占省级审定品种60%以上，其中直接利用γ射线辐照育成品种16个[19]，湖南省自1985年以来诱变创制育成品种45个，目前有多个品种年种植面积均在6.67万hm2以上[20]，而黑龙江省近20年间仅有五工稻1号和龙粳38号2个水稻品种是利用辐射诱变技术选育而成，仅占全省审定品种总数的0.68 %[21]。到目前为止，有关60Co-γ辐射影响黑龙江省水稻品种种子出苗及M1群体变化规律的研究还鲜有报道。因此，立足黑龙江省寒地稻作区，探索突破辐射育种研究成效差的现实瓶颈，助力新种质创新挖掘和新品种选育具有重要实践意义。

本研究以广适性水稻品种绥粳18为供试材料，利用220 Gy、250 Gy和280 Gy3个60Co-γ射线辐射剂量诱变其成熟种子，探索辐射诱变对其种子活力缓冲期、出苗限制因子以及M1群体遗传变异规律的影响，以期为开展替代或超越广适性品种绥粳18的新种质创新以及寒地水稻辐射育种可能有效途径的探索提供一定的种质基础和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为黑龙江省第二积温带广适性主栽水稻品种绥粳18，种子来源于黑龙江省农业科学院绥化分院。60Co-γ射线为辐射源，来源于黑龙江省农业科学院玉米研究所辐射研究室。试验于2019年在黑龙江省农科院绥化分院水稻育种试验基地进行。

1.2 试验方法

分别于2019年2月27日、4月2日进行干种子辐射处理2，辐照剂量为220 Gy、250 Gy和280 Gy，剂量率为1.1 Gy·min-1，以0 Gy处理为对照（CK），每个处理200 g种子。

1.2.1 发芽试验 选取2019年2月27日辐射处理和对照种子各500粒，分5期进行种子活力测定试验，时期（D）相隔5 d，第1期为3月4日（D1、5 d）、第2期为3月9日（D2、10 d）、第3期为3月14日（D3、15 d）、第4期为3月19日（D4、20 d）。3次重复。

1.2.2 出苗试验 选取4月16日（辐射后15 d）处理和对照种子育秧苗床播种，苗床上各选择500粒行出苗试验，3次重复。5月10日，各处理和对照秧苗本田栽插，每个处理10行，行长3 m，行距30 cm，株距13 cm，每穴1苗，生育期不防控稻瘟病，其他栽培管理与生产大田相同。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 发芽试验 种子用蒸馏水浸泡1 d，取出种子置入铺有一层滤纸发芽皿中，放置于25 ℃恒温培养箱（上海新苗qxh300）中培养。3次重复。以胚芽长度大于1 mm即视为发芽，每天观察其发芽数以计算发芽势和发芽率，共观测6 d。以培养箱中3 d发芽种子数计算发芽势，以6 d发芽种子个数计算发芽率。随机选取发芽后第6天芽苗30株，用游标卡尺分别测量其芽长和根长。发芽势（GP）(%)＝3 d发芽种子数/试验种子数×100 %；发芽率（GR）(%)＝6 d发芽种子数/试验种子数×100 %；发芽指数（GI）＝ΣGt/Dt(Gt指时间t发芽数，Dt指相应发芽日数)；根活力指数（RAI）＝S×ΣGt/Dt(S指发芽苗根长)。

1.3.2 出苗试验 4月24日（播种后8 d）调查出苗率，5月23日（播种后29 d）调查成苗率。成苗率(%)(SSR)＝成苗数/播种种子数×100。

1.3.3 本田调查考种 随机选择M1群体及对照处理各收获100个单株，选择分蘖数有代表性的10穗单株进行考种，调查成熟期、株高、分蘖穗数、穗实粒数、结实率、千粒重及穗颈瘟、倒伏情况。数据调查采集按照黑龙江省种子管理局下发的《水稻田间调查标准与技术规程》执行。

1.3.4 性状权重分析 基于熵权法的方案优选方法[22]，对M1群体及对照收获考种的材料进行综合熵权分析，具体实施步骤：

（1）设有m个待评单株、n个评价指标，评价各指标原始数据矩阵可表示为（1）式，标准化数据计算如式（2），确定标准化数据P：

式中Rij表示第i个评价对象第j个指标值。

式中Pij表示第i个评价对象第j个指标的综合标准化值，m为评价单元数量。

（2）对于第i个评价单株，第j个指标，其信息熵eij可表示为（3）式：

式中ej表示第j个指标的信息熵。

（3）第j个指标的客观权重，可表示为（4）式：

式中wj表示第j个指标的权重（熵权）。

1.4 数据分析

利用IBM SPSS Statistics25.0 统计分析软件进行方差和多重比较等分析，建立最优拟合度曲线估算回归方程。利用MATLAB（R2017a）软件编辑源代码，运行公式（1）—（3）求解。运用Origin2018数据分析软件绘图。本田试验中各处理均没有发生穗颈瘟和倒伏情况，280 Gy辐射处理M1群体生育期极晚无结实，这些指标及处理不进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 辐射对种子活力的影响

2.1.1 辐射缓冲期对种子活力影响 受不同缓冲期（辐射至播种时的间隔时间）影响，绥粳18种子发芽势和发芽率达到显著差异水平，芽长和根活力指数未达显著差异水平（图1）。D3处理发芽势92.0 %，发芽率97.8 %，与其他处理间差异水平趋势相同，均表现为D3处理大于D2和D1处理且达极显著差异水平，D4处理小于D3处理但未达显著差异水平；D3处理芽长19.7 mm，根活力指数155.1均大于其他处理。说明，缓冲期在D3处理时，60Co-γ辐射绥粳18种子活力最强。

图1 不同辐射缓冲期对绥粳18种子活力性状影响多重比较Figure 1 Multiple comparison of radiation buffer period on seed vitality traits of Suijing18

2.1.2 不同辐射剂量对种子活力影响 D3处理条件下，绥粳18种子发芽势、发芽率、芽长和根活力指数受不同辐射剂量处理影响，均达到显著差异水平（图2）。280 Gy处理发芽势94.0%大于其他处理，发芽势280 Gy与250 Gy处理间未达显著差异水平，但与0 Gy和220 Gy处理达极显著差异水平。250 Gy发芽率95.0 %，与其他处理达差异显著水平，随辐射剂量增加呈现先下降再升高趋势。280 Gy处理芽长12.6 mm，根活力指数50.0均为最小值，与0 Gy和220 Gy处理达极显著差异水平，与250 Gy处理未达显著差异水平，0 Gy处理芽长33 mm和根活力指数406.1均大于220 Gy处理且达极显著差异水平。说明D3处理的绥粳18种子，在0～280 Gy剂量范围内，辐射剂量增加对发芽势具有促进作用，对发芽率具有先抑制后促进作用，而对芽长和根活力指却具有抑制作用。

图2 D3缓冲期不同辐射剂量对绥粳18种子活力性状多重比较Figure 2 Multiple comparison of different dosages of radiation on seed vigor traits in Suijing18 during the buffer period of D3

2.2 辐射对种子出苗的影响

绥粳18种子出苗率和成苗率受不同辐射剂量处理影响而表现出差异性（图3）。出苗率和成苗率随辐射剂量增加而呈现相似的减少趋势，其中280 Gy处理时最小，均仅有7.0%，且与其他剂量处理达极显著差异水平；其次是250 Gy处理时出苗率25.0%、成苗率24.0%，与220 Gy、0 Gy处理达极显著差异水平；第3位是220 Gy处理时出苗率93.3%、成苗率92.0%，出苗率与0 Gy处理未达差异显著水平，成苗率与0 Gy处理达差异极显著水平。说明，在0～280 Gy60Co-γ辐射剂量范围内，绥粳18种子能够出苗即可成苗，辐射剂量增加对二者均具有抑制作用且达显著水平。

图3 不同辐射剂量对绥粳18种子出苗影响多重比较Figure 3 Multiple comparison of different radiation doses on seedling emergence of Suijing 18 seeds

2.3 辐射对M1群体主要农艺性状的影响

2.3.1 M1群体主要农艺性状遗传变异 绥粳18种子M1群体主要农艺性状表型值呈现不同差异（表1、图4）。主要农艺性状表型变异系数平均值大小依次为：穗实粒数（43.2%）＞结实率（40.7%）＞分蘖数（28.6%）＞株高（5.7%）＞成熟期（0.5%）＞千粒重（0.4%）。除千粒重变异系数各处理间未达显著水平外，其他农艺性状变异系数各处理间均达极显著水平。辐射处理间达显著差异水平的各性状中，0 Gy处理变异系数在0%～4.4 %之间，呈现出较好的稳定性；220 Gy处理变异系数在0.5%～47.0%之间，穗实粒数（47.0%）＞结实率（39.6%）＞分蘖数（39.0%）＞株高（6.3%）＞成熟期（0.5%）；250 Gy处理变异系数在0.9%～79.1%之间，穗实粒数（79.1%）＞结实率（78.1%）＞分蘖数（42.9%）＞株高（8.6%）＞成熟期（0.9%）。说明，辐射绥粳18水稻种子，在M1代出现了广泛的性状差异，可能存在可遗传变异，有利于育种选择。

图4 辐射M1群体主要农艺性状及变异系数多重比较Figure 4 Multiple comparison of main agronomic characters and coefficient of variation in population of radiation M1 population

表1 辐射M1群体主要农艺性状值比较Table 1 Comparison of main agronomic traits in population irradiated M1

成熟期随辐射剂量增加而延长，各辐射处理间达极显著差异水平，250 Gy处理成熟期平均值144 d，较0 Gy处理成熟期平均值134 d晚了11 d，田间试验280 Gy处理未成熟而没有收获籽粒，这种成熟期延长变异对受积温限制严格的寒地水稻育种是极其不利的；分蘖数有随辐射剂量增加而增多的趋势，且各辐射处理间达显著差异水平，250 Gy处理分蘖数多于220 Gy处理且达显著差异水平，多于0 Gy处理但未达显著差异水平，220 Gy处理分蘖数少于0 Gy处理但未达显著差异水平，并获得代号2501904、2501908、2501903、2501905和2201909分蘖数达42、37、32、32和31株的高分蘖突变株，说明高剂量辐射对植株分蘖能力有促进作用。株高、穗实粒数和结实率性状各辐射处理间达极显著差异水平，且呈现随辐射剂量增加而有减少趋势，其中株高平均值220 Gy、250 Gy时达101.1 cm、101.0 cm未达显著差异水平，但均低于0 Gy株高平均值109.7 cm且达极显著差异水平，说明辐射有抑制植株长高的作用，穗实粒数平均值0 Gy、220 Gy和250 Gy时为105.5粒、37.0粒和19.1粒且达极显著差异水平，结实率平均值0 Gy、220 Gy和250 Gy时为92.3 %、49.0 %和25.2 %且达极显著差异水平，说明辐射有抑制植株穗实粒结实的作用。

2.3.2 M1群体主要农艺性状的相关性 对3个辐射剂量6个农艺性状的相关性分析显示（表2），相关系数达显著水平有6个，约占16个相关关系的37.5 %。成熟期与株高、穗实粒数和结实率相关系数为–0.449、–0.846和–0.849，呈极显著负相关；株高与穗实粒数和结实率相关系数为0.612和0.570，呈极显著正相关；穗实粒数与结实率相关系数为0.963，呈极显著正相关，且为相关系数中最大值。以辐射剂量为自变量，以主要农艺性状为因变量，进行线性、二次、复合和Ligistic等11种函数最优拟合度曲线估算，获得拟合度极好的最优回归曲线方程（表3）。分蘖数和千粒重的11种拟合曲线F值不显著。株高最优二次函数P值为0.006达极显著水平，但R2最大值仅为0.314，其拟合度不好。成熟期、穗实粒数和结实率的二次函数拟合度R2值为0.958、0.895和0.767，其拟合度极好，说明，可以根据辐射剂量对这3个农艺性状进行拟合推测。

表2 辐射M1群体主要农艺性状的相关性分析Table 2 Correlation analysis of main agronomic characters in irradiated M1 population

表3 M1群体主要农艺性状对辐射剂量的回归分析Table 3 Regression analysis of main agronomic traits of M1 population to radiation dose

2.3.3 M1群体农艺性状分析 对3个辐射剂量6个农艺性状进行熵权分析（表4），权重值大小依次为：穗实粒数（0.528 01）＞结实率（0.352 72）＞分蘖数(0.113 87)＞株高（0.004 62）＞成熟期（0.00077）＞千粒重（0.000 01）。说明，穗实粒数、结实率和分蘖数的遗传变异程度，将直接影响收获单株的综合性状的表现。

表4 主要农艺性状指标权重值Table 4 Weight value of main agronomic traits

3 讨论与结论

高产、优质及多抗是水稻育种永恒的主题[23]，种质资源是遗传改良及新品种培育的重要物质基础[24-25]。实践证明诱变育种可以打破基因连锁，提高重组率，诱发产生自然界原来没有的或一般常规方法难以获得的新基因和新种质[26]。目前，黑龙江省稻种质资源相对匮乏且遗传基础相对狭窄[27-28]，严重制约着突破性水稻新品种选育，引入60Co-γ射线辐射源，探索广适性品种绥粳18辐射诱变效应规律，挖掘利用起源头作用的优异种质资源，将是目前黑龙江选育突破性水稻新品种的可能有效途径。

3.1 不同辐射后缓冲期对种子活力的影响

耿兴敏等[29]研究表明，60Co-γ辐射处理后的砂藏期对桂花种子萌发状况有影响。吕秀珍等[30]研究发现，大豆种子辐射后随着贮藏日数增加而生长受抑制。作者查阅文献关于水稻辐射后贮藏的缓冲期研究还鲜见报道。本研究通过绥粳18种子辐射后到播种时的缓冲期试验室种子活力测定方法，获得种子发芽势、发芽率、芽长和根活力指数在辐射后15 d时最佳，明确了缓冲期15 d时为辐射种子最适宜土壤苗床播种期，规范统一有效的苗床播种时间，将有助于辐射后代材料表型遗传性状的充分表达。

3.2 不同辐射剂量对种子活力和出苗的影响

前人研究表明，随着辐射剂量的加大，水稻种子发芽率明显降低[17,31]。刘春贵等[32]研究表明，适宜剂量可以有效打破种子休眠，提高种子发芽率。谢崇华等[33]研究发现，辐照对水稻种子发芽势和发芽率影响不明显，对水稻存活率有明显影响。吴茂力等[34]研究表明，随着γ射线辐照处理剂量的加大，供试陈种子的发芽势、发芽率和发芽指数呈先升高，后又逐渐下降的趋势。本研究表明，在0～280 Gy60Co-γ辐射剂量范围内，辐射剂量增加会对绥粳18种子发芽势有显著促进作用，发芽率有先抑制后促进的显著作用，对芽长和根活力指数有显著抑制作用，对土壤苗床出苗率和成苗率具有显著抑制作用。结合试验室种子活力和土壤苗床出苗率测定分析，明确了根活力指数和芽长成为了限制辐射种子出苗和成苗的主要因子，这可能与品种种子拱土能力有关，但还待进一步研究。

3.3 不同辐射剂量对M1群体遗传变异的影响

本研究通过绥粳18种子辐射后M1群体主要农艺性状遗传变异规律统计分析表明，在0～250 Gy60Co-γ辐射剂量范围内，随着辐射剂量增加成熟期延长、分蘖数增加、株高变短、穗实粒数变少、结实率变小且达显著差异水平，千粒重变化小未达显著差异水平。成熟期延长与吴世长等[35]研究结果相同，但分蘖数增加却与其研究结果不同。株高变短与富昊伟[36]研究结果相同，但与李伟等[17]研究结果不同。结实率变小与前人[17,35-36]研究结果相同。千粒重变化不显著与李伟等[17]研究结果不同。这些不同表现，可能是不同品种基因型受辐射影响效应不同所致，但还需要进一步探索。本研究表明，60Co-γ射线辐射能够使M1群体主要农艺性状产生变异系数在0.4%～79.1%范围内的遗传变异突变体材料，高辐射剂量对成熟期和分蘖数有促进作用达极显著差异水平，对株高、穗实粒数和结实率有抑制作用达极显著差异水平。M1群体主要农艺性状间存在相关性，表现为成熟期与株高、穗实粒数和结实率呈极显著负相关，株高与穗实粒数和结实率呈极显著正相关，穗实粒数与结实率相呈极显著正相关，同时穗实粒数、结实率和分蘖数的遗传变异权重较大，将直接影响收获单株的综合性状的表现，为此可明确今后辐射世代育种材料选择，要注重早熟、分蘖力强、植株较高、穗粒数多和结实率高等遗传变异性状的筛选。这些辐射材料后代能否遗传相关性状还待进一步研究。本研究结果为开展替代或超越广适性品种绥粳18的新种质创新以及寒地水稻辐射育种途径的探索提供了一定的种质基础和技术参考。