外源鲨烯和茉莉酸甲酯对印楝素生物合成代谢网络的影响

邱 枫，谢婷婷，荀 航，王煜炜，姚 曦，汤 锋*

(1. 安徽农业大学植物保护学院，合肥 230036；2. 国际竹藤中心，国家林业和草原局竹藤科学与技术重点实验室，北京100102)

印楝素（Azaidrachtin）是从印楝（Azadirachta indica）中提取的一类四环三萜类化合物，具有拒食、趋避和干扰昆虫生长发育等多种生物活性，是目前开发最成功的植物源杀虫剂之一，已在中国、美国、加拿大和印度等多个国家登记使用，市场需求巨大[1]。其主要活性成分是印楝素A和B，约占99%，其中印楝素A的含量最高，活性最强[2-3]。

目前对印楝素生物合成途径的认识，基本停留于推理和假说层面。Akhila等利用14C标记研究印楝素、nimbin及茄碱苷的生物合成途径，证明甲羟戊酸参与了3种物质的合成[4]；Seigler等推测2,3-环氧鲨烯在酶的催化下形成大戟二烯醇，再经一系列反应生成印楝素A[5]。谢婷婷等利用印楝素A无细胞合成体系，通过外源添加底物，证明羊毛甾醇不是印楝素A的合成前体，2,3-环氧鲨烯和丁酰鲸鱼醇是印楝素A的前体，nimbin、大戟二烯醇、脱乙酰茄碱苷和茄碱苷极可能是印楝素A的合成前体，并且茄碱苷位于合成途径较下游的位置[6]。

印楝素生物合成涉及多种酶促反应，在植物体内开展研究难度极大，进展缓慢。因此，借助现代组学技术，探讨印楝素生物合成途径，受到科学家的关注。Krishnan等完成了印楝基因组的测序，筛选出8个可能与印楝素生物合成相关的基因[7-8]；Kurvadi等通过高通量测序和UPLC技术，获得150余个可能涉及印楝素合成的候选基因[9]。代谢轮廓分析是连接代谢组学和功能基因组学的纽带，无论是在细胞和植株层面上实施诱导，还是分子水平上操纵基因，都需要知道代谢产物的应答表现[10]。

因此，本研究在前期研究基础上，以印楝愈伤组织为材料，研究前体（鲨烯）和诱导子（茉莉酸甲酯）处理后印楝代谢轮廓的变化，分析差异代谢产物，探讨鲨烯和MeJ对印楝素生物合成代谢网络的影响，以期为揭示印楝素生物合成途径，深入认识印楝素代谢网络和调控机制提供依据，为利用生物技术合成和提高印楝素产量提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料 印楝为4年生植株。印楝种子采于中国林业科学研究院资源昆虫研究所元江试验站（云南省元江县），常规消毒后，室温浸种48 h，播种于营养钵中育苗。实生苗转盆后，置于中国林业科学研究院温室中常规盆栽。

1.1.2 主要试剂及仪器 （1）主要试剂。Azadirachtin B、Azadirachtin D、Azadirachtin H、Azadiradoine、Nimbin及Salannin为实验室分离制备所得[11]；Azadirachtin A购于Sigma公司。色谱级甲醇、乙腈及乙醇购于默克公司；超纯水由Milli-Q超纯水系统制备得到。

（2）主要设备仪器。超高效液相色谱系统（日本岛津实验器材有限公司Shimadzu CBM30A）；串联四极杆-飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）（美国赛默飞世尔科技有限公司）；研磨仪（德国弗尔德仪器设备有限公司MM 400）。

1.2 研究方法

1.2.1 样品制备与提取 愈伤组织分别饲喂100 μmol·L-1MeJ、500 μmol·L-1鲨烯及同时饲喂100 μmol·L-1MeJ和500 μmol·L-1鲨烯，培养24 h后收集，真空冷冻干燥7 d后备用，以无菌水为对照，每处理重复3次。

用研磨仪按30 Hz的频率，将冻干后的愈伤组织样品研磨1.5 min，至粉末状。称取100 mg样品粉末，加1.0 mL 70%甲醇，4 ℃静置提取24 h；10 000 g离心10 min，收集上清液，经吸附柱（CNWBOND Carbon-GCB SPE，250mg，3mL）和微孔滤膜（0.22 μm）过滤，待检测。

1.2.2 检测条件 （1）色谱条件。Waters Acquity UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）色谱柱，流动相A和B分别为0.04%乙酸水溶液和含0.04%乙酸的乙腈溶液。采用梯度洗脱，梯度设置为：0 min，A∶B = 95∶5；11.0 min，A∶B = 5∶95；12.0 min，A∶B = 5∶95，12.1～15.0 min，A∶B = 95∶5。流速0.4 mL·min-1，柱温40℃，进样量2 μL。

（2）质谱条件。电喷雾正离子电离模式，质量扫描范围50～2 000 Da，碰撞气为高纯氮气（N2）。电喷雾离子源（ESI）温度500℃，毛细管电压5 500 V，帘气25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。通过去簇电压和碰撞能优化进行扫描检测。

1.2.3 定性定量分析 基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建数据库MWDB（metware database）及代谢物信息公共数据库，根据一级和二级谱信息，去除对数据分析有影响的同位素信号和含K+、Na+和NH4+等离子及大分子量物质的碎片离子等重复信号，对代谢物进行定性。利用三重四级杆质谱的多反应监测模式，以特征离子峰面积进行定量。

1.2.4 试验数据处理 运用主成分分析法（PCA）进行无监督分析，预判不同处理的整体趋势，随后利用有监督的正交偏最小二乘法（OPLS-DA）进行数据分析，验证OPLS-DA模型的拟合程度。基于OPLS-DA结果，差异倍数（fold change，FC）与VIP结合筛选差异代谢物。筛选标准为FC≥1.5或≤0.66，且VIP值≥1。

2 结果与分析

2.1 数据质量及代谢物总体分析

2.1.1 主成分分析结果 在PC1维中，MeJ、鲨烯（SS）以及MeJ和鲨烯共处理（MS）样品与对照组（CK）存在显著的分离趋势，表明3种处理代谢物与对照组存在显著差异（图1）。SS组与MeJ和MS组之间分离显著，表明鲨烯对代谢物影响与MeJ存在差异。MeJ、SS、MS和CK4种处理在PC2维上分离显著。

图1 主成分分析结果Figure 1 Results of principal component analysis

2.1.2 OPLS-DA分析结果 MeJ、鲨烯以及MS分别与对照组比较，3组的预测参数R2X、R2Y和Q2均接近1，表明模型稳定可靠，可以做后续的差异成分的筛选（图2）。

图2 OPLS-DA分析图Figure 2 OPLS-DA analysis diagram

2.1.3 代谢物种类及其分布 基于MWDB数据库及代谢物信息公共数据库，通过质谱信息检索，共鉴定出767种代谢物。442个代谢物分布在初生代谢途径，其中有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和脂质3类物质数目最多，分别占初级代谢物的26.7%、21.9%和15.6%。鉴定次生代谢产物287个，其中黄酮类代谢物最多（169个），占次生代谢物的58.9%，萜类代谢物14个。有38个代谢物未得到明确分类（图3）。

图3 代谢物总分布Figure 3 Metabolite profile

2.2 鲨烯和MeJ对印楝愈伤组织初生代谢的影响

2.2.1 MeJ对印楝愈伤组织初生代谢的影响 MeJ处理影响印楝52种初级代谢物，27种表达上调，25种表达下调，见图4（a）。涉及糖类、氨基酸和脂类等8类，其中对有机酸及衍生物（17种）、脂质（14种）和氨基酸及衍生物（10种）影响较大。除5种奎宁酸类物质外，其余有机酸类均有明显的增加。MeJ强烈促进脂肪酸十三烷内脂的合成，多数甘油磷脂的代谢明显提高。L-高瓜氨酸、高精氨酸和N-(3-吲哚乙酰基)-L-丙氨酸代谢降低，其余氨基酸类代谢均增强。

2.2.2 鲨烯对印楝愈伤组织初生代谢物的影响 鲨烯影响49种初生代谢物的合成，其中36种表现为下调，见图4（b）。共有8类差异代谢物，对有机酸及衍生物影响最大（15种），除3,5-二羟基-3-甲基戊酸、6-氨基己酸、延胡索酸和D-泛酸等4种上调，其余有机酸均受到抑制。13种胺类代谢物受到影响，酚胺类物质受到抑制，色胺类物质代谢增强。

2.2.3 鲨烯和MeJ共同作用对印楝愈伤组织初生代谢物的影响 鲨烯和MeJ的协同作用显著调控愈伤组织的初生代谢，影响7类53种初生代谢物，34种表现下调，19种为上调，见图4（c）。有机酸及衍生物受影响最大（17种），8种表现为上调。与单独处理结果一致，两者共处理抑制奎宁酸的代谢。其次为胺类物质（10种），其中酚胺和色胺类物质的代谢受到抑制。10种氨基酸及衍生物受到两者共同调控，其中4种氨基酸的代谢上调。

图4 MeJ和鲨烯处理影响初生代谢物分布Figure 4 The distribution of primary metabolites treated with MeJ and squalene

2.3 鲨烯和MeJ对印楝愈伤组织次生代谢物影响

2.3.1 MeJ对印楝愈伤组织次生代谢的影响 经MeJ处理后，差异次生代谢物有80种，47表达上调，33种下调，包括4种生物碱类、4种萜类和72种苯丙烷类及衍生物。其中黄酮类物质最多（47种），大部分受到抑制；其次为酚类物质（25种），13种代谢上调。这与甘草、蒙古黄芪等植物中的研究结果一致[12-15]。MeJ调控的4种萜类物质为印楝素B、诺米林、葫芦素E和Azadiradione，其中前3种代谢受到抑制。

2.3.2 鲨烯对印楝愈伤组织次生代谢物的影响 鲨烯处理后差异次生代谢物共88种，20种上调，68种下调（图5）。苯丙烷类及衍生物中差异代谢物最多（80种），其中黄酮类物质65种，占74.7%。其次为萜类物质，包括印楝素A、B、H及Salannin、Nimbin。除印楝素B外，其余物质代谢均上调。

图5 MeJ和鲨烯影响次生代谢物分布Figure 5 The distribution of secondary metabolites treated with MeJ and squalene

2.3.3 MeJ和鲨烯对印楝愈伤组织次生代谢物的共同影响 MeJ和鲨烯对印楝代谢有协同增效作用。MeJ和鲨烯共处理有79种差异次生代谢物，33种上调，46种下调。6种萜类物质代谢发生明显变化，其中印楝素A、Azadiradione和Nimbin代谢上调，印楝素B、诺米林和葫芦素E代谢受抑制。此外，MeJ和鲨烯的协同作用对4种生物碱的代谢也有明显调控。

2.4 种柠檬苦素类物质的靶向代谢分析结果

选取印楝素A、B、D、H及Azadiradione、Nimbin、Salannin等7种柠檬苦素类物质进行靶向代谢分析，结果表明，鲨烯、MeJ以及两者共存时，均能显著促进印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成，对印楝素B、D的合成具有抑制作用。鲨烯促进印楝素H的合成，MeJ不仅抑制印楝素H的合成，并能抵消鲨烯的作用（表1）。MeJ和鲨烯处理后印楝素A合成增加，印楝素B、D合成受到抑制，表明其存在竞争关系。印楝素A和B结构相似，仅丁烯酯部分环氧结构上的-H和-OH不同[16]。说明MeJ可能通过调控印楝素B合成后期修饰酶活性，使更多的前体进入印楝素A的代谢流。

表1 MeJ和鲨烯处理对柠檬苦素类代谢物的影响Table 1 Effects of MeJ and squalene on 7 limonin metabolites

前人研究发现，紫外灯照射下，印楝粗提物溶液通氧后Salannin和Nimbin可分别氧化为含有印楝素结构和高生物活性的Isosalanninolide和Isonimbinolide，在植物体内亦发现了此类物质[17-18]。谢婷婷等亦发现，以Nimbin和Salannin为底物时印楝素A的产量显著增加，认为两者是印楝素A的合成前体[6]，代谢物差异分析结果进一步验证Nimbin和Salannin是印楝素A合成前体。

Hansen等发现，Azadirone经氧化、环化及质子化等反应，最终可合成Salannin和Nimbin[19]。由于具有特有的氧化模式，Azadiradione和Azadione是许多柠檬苦素类和四环三萜类化合物的合成前体[20]。Azadiradione合成与印楝素A变化趋势一致，可推测Azadiradione亦为印楝素A合成前体。

2.5 鲨烯和MeJ对印楝素合成代谢网络的影响

2.5.1 MeJ和鲨烯对印楝素合成初生代谢网络的影响 印楝中碳水化合物代谢为MVA及MEP途径提供乙酰CoA、丙酮酸和3-磷酸甘油醛。三萜类物质的前体主要来自MVA途径，MVA途径和MEP途径在植物体中可通过IPP进行交流，因此两种途径均调控三萜物质的合成（图6）。

图6 萜类代谢相关网络Figure 6 Network diagram of terpenoids metabolism

MeJ和鲨烯影响葡糖酸内酯、葡萄糖酸、D-果糖-6-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸等4种糖类物质的代谢。葡糖酸内酯和葡萄糖酸可通过Entner-Doudoroff pathway反应产生3-磷酸甘油醛，D-果糖-6-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸经糖酵解过程生成丙酮酸。乙酰CoA不仅是MVA途径合成萜类物质的前体，也是三羧酸循环不可或缺的参与者。经鲨烯处理后，愈伤组织中延胡索酸和苹果酸含量有不同程度地增加，而柠檬酸和α-酮戊二酸含量减少，表明TCA循环增强且向合成更多的乙酰CoA的方向进行，释放大量的能量，利于印楝素的合成。此外，乙酰CoA还是一种重要的乙酰基供体[21]，从鲨烯到印楝素的合成过程，涉及多步乙酰化反应，大量乙酰CoA的合成有利于鲨烯向印楝素的合成。

MeJ和鲨烯调控豆蔻酸的代谢，且多种不饱和脂肪酸产量显著变化。研究表明，豆蔻酸调控MVA途径，不饱和脂肪酸通过提高胞压和影响酶活促进MVA途径的代谢[22]。因此MeJ利用调控部分糖类和脂类的代谢影响印楝素的合成，鲨烯通过部分糖类和脂类的代谢以及TCA循环影响印楝素的合成。

2.5.2 MeJ和鲨烯对印楝素合成次生代谢网络的影响 鲨烯是植物三萜和固醇类物质的共同前体，减少固醇类物质的合成有利于鲨烯参与三萜类化合物的合成。MeJ处理后，愈伤组织中印楝素A合成增加，而固醇类物质维生素D的含量下降。同时添加MeJ和鲨烯，愈伤组织中维生素D含量仍明显减少，印楝素A的增加量高于MeJ单独处理，表明MeJ可通过抑制固醇类物质的合成促进印楝素代谢。磷酸吡哆醛是140多种细胞酶的辅酶，涉及氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶及合成酶6大酶类，在众多细胞代谢中不可或缺[23]。印楝素生物合成涉及多种氧化、环化和异构等酶的参与，鲨烯促进磷酸吡哆醛的合成，有利于提高印楝素后期结构修饰相关酶的活性。

综上所述，MeJ通过促进Entner-Doudoroff pathway反应，糖酵解等初生代谢，抑制固醇类物质合成等次生代谢，进而调控印楝素的合成。鲨烯除影响Entner-Doudoroff pathway反应和糖酵解外，还通过调控三羧酸循环、脂质代谢以及结构修饰相关酶的活性，影响印楝素的合成。

3 结论

MeJ和鲨烯显著影响印楝愈伤组织的代谢活动，MeJ处理后共检132种差异代谢物，包括52种初生代谢物和80种次生代谢物。MeJ调控有机酸、脂质、氨基酸以及黄酮类和酚类物质的代谢，抑制印楝素B、诺米林和葫芦素E的合成。鲨烯处理检出137种差异代谢物，32种代谢物表达上调。靶向代谢组分析表明，MeJ和鲨烯显著促进印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成，对印楝素B，D的合成具有抑制作用。表明Nimbin和Salannin是印楝素A生物合成途径的中间代谢物，Azadiradione参与印楝素A的合成。

基于差异代谢物的分析，绘制了MeJ和鲨烯影响印楝素合成的相关代谢网络，MeJ通过促进Entner-Doudoroff pathway反应，糖酵解等初生代谢，抑制固醇类物质的次生代谢，调控印楝素A的合成。鲨烯影响Entner-Doudoroff pathway反应和糖酵解，通过干预三羧酸循环、脂质代谢以及结构修饰相关酶的活性影响印楝素A的合成。