甲基紫显色法研究几种常见中药成分的抗氧化自由基活性及其机理*

郭新颖，顾 俊，陈 峰，戴志英，杨梅桂

（南通市疾病预防控制中心 理化科，江苏 南通226007）

羟自由基（hydroxyl free radical，·OH）是机体中活性氧的一种，它不仅是维持正常生命过程的必需物质，还是杀死红细胞、降解DNA、细胞膜和多糖化合物的元凶[1-3]。作为生物体的破坏者，在体内自由基失衡的非正常的生理水平上，·OH通过攻击生物大分子导致组织细胞损伤，从而引起人类的各种疾病[4-6]。因此，为清除体内多余自由基，国内外已将具有抗氧化成分的天然与合成类抗氧化剂的研究开发作为主要方向，尤其是对中药进行了大量研究[7-10]。本文从中药提取物的的清除·OH的能力作为其主要抗氧化指标，以甲基紫（methyl violet，MV）作为显色剂，结合分光光度法的试验方法进行了中药清除·OH作用的初步研究，对可能产生的反应机理进行了分析探讨，以期对中药进行体外抗氧化活性相关研究提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

UNICO7200型分光光度计（上海分析仪器厂）；FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；CS501超级恒温槽（重庆实验设备厂）；PHS-3CpH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；量筒、称量纸、玻璃搅拌棒、药品勺、试剂瓶若干。

1.2 材料与试剂

甲基紫（5.15×10-5mol·L-1），FeSO4（1.5×10-4mol·L-1），H2O2（0.3%），Na2HPO4,柠檬酸，H3PO4，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；中药为市售。

Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制9.35mL 0.2mol·L-1Na2HPO4和10.65mL 0.1mol·L-1柠檬酸混合，HCl精确调至pH值为4.5。

1.3 试验原理

Fenton试剂反应是目前已知的产生·OH的经典方法，·OH是在整个反应中起主要氧化作用的物质，它与有机染料如染色剂、显色剂、荧光剂、抗氧化剂等反应的主要途径是夺取氢原子、发生电子转移以及产生加成反应的过程。目前，公认的铁基Fenton体系的反应方程式可简便表述为：

从以上反应简式看出，反应式中的整条反应链实际上是在Fe2+的催化作用下将H2O2全部消耗生成H2O和O2的净反应，中间产物·OH可引发链反应产生更多自由基来消耗目标物。本试验是以甲基紫MV作为有机化合物，在酸性条件下显色，反应体系中·OH凭借极高的电负性（Ep=2.80V）有选择性地进攻甲基紫的高电子云密度点如-C=C-基团，同时发生亲电加成反应，以甲基紫褪色作为反应终点[11]。

1.4 计算公式

·OH清除率实验是体外抗氧化活性试验的一种常用的评价检测方法，主要是利用显色剂在含有·OH的反应体系中会降低体系的吸光度，而吸光强度的降低程度又与·OH有着比较明显的量效关系，因而可以根据这个原理间接地测定·OH的产生量，从而较为准确地评价某一物质的体外抗氧化活性[12]。

反应体系清除率CR%的计算公式为：

其中，加入抗氧化剂的反应体系吸光度值记作AS，未加入抗氧化剂的反应体系吸光度值记作A，空白参比吸光度值记作A0，·OH反应前后溶液的吸光度变化差值记作ΔA。计算结果用百分制（%）表示。

1.5 样品处理

中药经清洗晾干后用粉碎机粉碎。准确称取粉末5.0g，用50mL蒸馏水水浴加热60min，过滤离心后得到中药水提物，试验时取处理后的上清液1mL待测。

1.6 样品测定

试验测定参照刘立明[13]的方法。在2支10mL比色管中按先后顺序依次加入1.0mL 5.15×10-5mol·L-1MV溶液和1.0mL Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH值为4.5），一支作为试剂空白参比，另一支继续加入1.0mL 1.5×10-4mol·L-1FeSO4溶液和1.0mL 0.3%的H2O2溶液作为反应体系。两体系溶液均定容至10.0mL，室温放置5min后，在分光光度计上以582nm吸收波长配1cm比色皿测定各体系吸光度变化值ΔA并计算清除率CR%。

2 结果与讨论

2.1 体系吸收光谱

在pH值为4.5的弱酸性介质中，分别测定MV和MV-Fe2+-H2O2溶液的吸收曲线，得到的两种溶液吸收光谱图。试验发现，单一MV溶液和MV-Fe2+-H2O2反应体系溶液的最大吸收波长均在582nm附近且吸光度值不变，被氧化的MV-Fe2+-H2O2反应体系溶液吸光度明显降低，但是最大吸收波长并没有变化，因此，本试验确定两体系溶液的测定波长为582nm。

2.2 试验影响因素分析

2.2.1 显色剂用量的影响 由于显色剂MV的浓度大小对反应现象的观察与检测有较大影响，故有必要对MV的用量进行考察。本试验选择浓度为5.15×10-5mol·L-1的MV溶液，考察了MV溶液体积分别为0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7个不同体积用量对体系吸光度的影响。结果见图1。

图1 显色剂用量的影响Fig.1 Effect of different volume and dosage of chromogenic reagent

由图1可见，ΔA值随MV用量的逐渐增大而增加；当用量达1.0mL时ΔA值最大，故本试验选用MV溶液1.0mL。

2.2.2 酸度的影响 分别配制pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0共7个pH值的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液进行试验，结果见图2。

图2 酸度的影响Fig.2 Effect of pH

由图2可知，在弱酸条件下有利于Fenton反应中·OH的生成，故本试验选用pH值为4.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，按试验方法分别测定空白体系与反应体系的吸光度差值ΔA。结果表明，在一定范围内，ΔA值随酸度用量增加而增大；当用量为1.0mL时，ΔA值趋于最大，综合考虑将本试验缓冲溶液的用量定为1.0mL。

2.2.3 Fe2+用量的影响FeSO4作为反应体系的反应物浓度，Fe2+的浓度会对·OH的产生量产生影响，本试验选用1.5×10-4mol·L-1的FeSO4溶液，按实验方法对Fe2+体积分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7个不同用量对体系吸光度的影响进行分析。结果见图3。

图3 Fe2+用量的影响Fig.3 Effect of different volume of Fe2+

由图3可知，随着FeSO4用量的增加，ΔA呈现增大的趋势；当用量达到1.0mL时ΔA趋于稳定。故本试验FeSO4溶液的用量为1.0mL。

2.2.4 H2O2用量的影响 ·OH的产量和反应程度也受反应物H2O2浓度的影响。分别加入体积为0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7个不同用量的0.3% H2O2溶液，考察吸光度变化值ΔA。结果见图4。

图4 H2O2用量的影响Fig.4 Effect of different volume of H2O2

由图4可知，在一定范围内，ΔA随着H2O2用量的增加而增大；当用量超过1.0mL时，ΔA吸光度值变化不大，故本实验选用H2O2溶液1.0mL。2.2.5反应时间的影响 试验考察了反应时间分别为1、2、4、6、8和10min共6个时间点对体系的吸光度变化值ΔA影响。结果发现，在0~5min内，吸光度随时间的增大而增大，5min后ΔA值基本无变化。故本试验测定时间选为5min。

2.3 中药提取物的抗氧化活性

本试验以抗·OH清除能力作为评价中药体外抗氧化活性的性能指标，对当归、山楂、葛根、菊花和枸杞等5种中药水提取物的抗·OH清除能力（以清除率计）进行了测定，结果见表1。

表1 5种中药提取物对·OH的体外清除作用（n=6）Tab.1 Scavenging effects of extracts in 5 TCMs（n=6）

由表1可见，5种中药水提物都有一定程度的抗·OH清除能力，但清除能力大小有较大差别，5种中药·OH清除能力及清除率数值从大到小依次为：当归45.28%，山楂42.17%，葛根38.58%，菊花33.41%，枸杞12.94%。5种中药·OH清除能力的不同反映了其各自抗氧化能力的大小，这表明5种中药水提物存在不同组分的抗氧化活性物质，也间接证明了这5种中药抗氧化能力的大小或可与各物质所含有的不同抗氧化成分有关。

2.4 中药抗氧化的机理

探讨近年来所有生化研究中的芬顿（Fenton）反应型中，已知的几种中药主要抗氧化成分最受关注的是黄酮类化合物，因其结构式中含有若干个苯环三碳链（C6-C3-C6）骨架和酚羟基（直接与芳香烃相连的羟基，R-OH），且目前已知的多数中药提取物中均可分离出具有较强的清除自由基能力的黄酮类物质[14]。鉴于此，本试验所选取的5种中药均具有抗氧化成分黄酮类，认为这几种中药中的黄酮类化合物可以通过直接与芳香烃相连的羟基（酚羟基，R-OH）与·OH反应生成稳定化合物中断链式反应，抑或与铁基金属离子络合降低催化反应速率，通过以上作用机制来清除体系·OH。也有研究指出，中药的加入之所以能够防止机体过氧化，是因为中药成分中的黄酮类化合物以氢键形式发生反应[15]，通过阻止体系的不饱和键与·OH上的不成对电子接触或反应，以此降低过氧化程度，使中药的抗氧化能力得到有效保护。同时，本文以甲基紫-芬顿体系（MVFenton）作为体外模拟试验体系中，发挥主要催化作用的是Fe2+，·OH处于激发态且带有一个不成对电子，Fe2+的加入会将·OH催化分解为H2O2，从而抑制·OH的过氧化作用。以上反应机理与本文对中药的抗氧化机理的研究相一致。

3 结语

本文通过选择MV作为试验显色体系，以中药的抗·OH清除率作为评价中药的抗氧化活性指标，对5种中药水提物进行体外抗氧化活性的比较分析，对中药在体外的抗氧化性能的反应机制及其机理研究进行了初步探索。以上试验结论可以为在体内的中药作为抗氧化剂抗氧化作用和生理功效的关系研究提供相关理论参考。总之，中药作为天然药物的来源，因其毒副作用小、安全性高，因而具有广阔的应用前景。但由于中药成分的复杂性，抗氧化机理研究等尚处于初步探索阶段，针对中药抗氧化成分分析及其作用机制尚有待于更加深入的试验研究。