石榴皮中黄酮类物质的提取及抗氧化研究*

张丽君，李 敏，王 静，鲁强国，马潘潘

（西安文理学院 化学工程学院，陕西 西安710065）

石榴素以色泽艳丽，果大皮薄，汁多味甜，核软鲜美，籽肥渣少，品质优良等特点而著称。石榴皮、花、叶、根部都可入药,它性味甘、酸、温、涩而无毒，并含有多种生物碱、鞣质等。现代药理研究也表明，石榴皮中含有多种生理活性物质，具有抗癌、镇痛、抗菌、抗病毒、抗氧化、提高免疫能力等药用保健功能,还有降压、降血脂、增加冠脉流量、强心、抗心律不齐等药理作用[1]。石榴皮主要成分有鞣质酸类化合物、没食子酸类化合物、黄酮类化合物、有机酸类化合物、生物碱类化合物。石榴皮中含量较高的黄酮类化合物，能够降低不同类型自由基的活性，具有一定的药用价值。作为天然抗氧化剂可以从天然食材中提取得到，相比合成抗氧化剂具有其他生物学功能，日益被国内外关注[2]。

江飞凤[3]等以柚子皮为原料，采用超声-微波协同提取技术提取柚子皮多糖，优化最佳提取工艺，对其进行脱色、脱蛋白处理，对其单糖组成、结构和抗氧化活性进行分析。本文采取乙醇浸提法、纤维素酶辅助法、超声波法及微波法从石榴皮中提取黄酮。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定石榴皮提取液中黄酮类物质的含量,并进行体外抗氧化研究，研究对种自由基的清除作用，为石榴作为天然抗氧化剂和功能性食品的开发利用提供理论基础和实验依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

石榴皮（西安老百姓大药房）；芦丁（AR国药集团化学试剂有限公司）；NaNO2（AR西安化学试剂厂）；Al（NO3）3（AR西安富力化学厂）；NaOH（AR西安化学试剂厂）；VC（AR天津市天力化学试剂有限公司）；无水乙醇（AR天津市天力化学试剂有限公司）；FeSO4·7H2O（AR汕头市西陇化工厂有限公司）；水杨酸（AR天津市天力化学试剂有限公司）；三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（AR阿拉丁）；邻苯三酚（AR天津市科密欧化学试剂有限公司）；DPPH试剂（AR阿拉丁）。

FW80型微型高速万能粉碎机（郑州科丰仪器设备有限公司）；722N型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；YP202N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；SB-5200DT型超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LWMC-205型微波反应器（南京陵江科技开发有限公司）。

1.2 方法与步骤

1.2.1 黄酮类化合物的提取

1.2.1.1 样品与处理 称取石榴皮200g，在烘箱中60℃烘干24h，取出后用粉碎机粉碎备用。

1.2.1.2 各种提取方法的最佳工艺条件（见表1）

表1 各提取方法的最佳工艺条件Tab.1 Optimum conditions for each extraction method

1.2.1.3 乙醇索氏提取 称取3g石榴皮样品，装入滤纸桶中，量取60mL 65%的乙醇，倒入250mL的圆底烧瓶，安装好索氏提取器，开始反应，虹吸5次左右，离心后得到石榴皮提取液，最后用65%乙醇定容到100mL容量瓶中。

1.2.1.4 纤维素酶辅助法 称取3g石榴皮样品装入100mL烧杯中，加入30mL蒸馏水和7.5mg纤维素酶，调节pH值为6~7，在45℃水浴中酶解30min，倒入250mL圆底烧瓶中，加入30mL 95%乙醇，保持温度90℃，回流1.5h，离心后得到石榴皮提取液，最后用95%乙醇定容到100mL容量瓶中[4]。

1.2.1.5 超声波法 称取3g石榴皮样品装入250mL烧杯中，加入60mL 60%乙醇，在50℃条件下超声25min，离心，取上清液，合并滤液，用60%乙醇定容到100mL容量瓶中[5]。

1.2.1.6 微波法 称取3g石榴皮样品装入250mL烧杯中，加入75mL 70%乙醇，在功率为600W条件下微波3次,每次2min，离心，取上清液，合并滤液，用70%乙醇定容到100mL容量瓶中[6,7]。

1.2.2 石榴皮中黄酮类物质的含量测定

本实验利用NaNO2-Al（NO3）3比色法，即在中性或弱碱性及NaNO2存在下，黄酮与铝盐生成螯合物，加入NaOH显红橙色。准确称取芦丁标准品10.00mg于小烧杯中，用30%乙醇溶解，定容于50mL的容量瓶，摇匀。得到浓度为0.2mg·mL-1的芦丁标准溶液。准确吸取标准液0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL于25mL容量瓶中，编号为1~6。加入5%的NaNO2溶液0.4mL，摇匀，放置6min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL，摇匀，放置6min后加入4%的NaOH溶液4mL，再用30%乙醇定容，摇匀。以试剂空白为参比，15min后于490~530nm内扫描，确定最大吸收波长。在最大吸收波长处，测定不同浓度芦丁标准品的吸光度，得到吸光度A与芦丁含量C（mg·mL-1）之间的回归方程。

将4种方法提取所得的4组粗提液，分别吸取1.0mL于25mL的容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.4mL，摇匀，放置6min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL，摇匀，放置6min后加入4%的NaOH溶液4mL，再用30%乙醇定容，摇匀，以试剂空白为参比，15min后，在最大吸收波长处测定吸光度，代入回归方程中即可求得石榴皮中黄酮类物质的含量（质量浓度），从而来计算石榴皮中黄酮类物质的提取率。石榴皮中黄酮类物质的提取率=[（提取液浓度×体积×稀释倍数）/原料质量]×100%

1.2.3 抗氧化性实验

1.2.3.1 清除DPPH·自由基能力的测定 准确称取DPPH·0.0079g于小烧杯中，用无水乙醇溶解，定容于100mL的容量瓶，摇匀后得到浓度为0.2mmol·mL-1的DPPH·溶液。在25mL比色管中加入2mL 0.2mmol·mL-1DPPH·溶液再加入2mL无水乙醇，摇匀后温室避光静置30min，在517nm处测量吸光度，平行测定3次，取其平均值得到A0；同样的方法，再加入5份不同浓度的石榴皮提取液、VC和提取液+VC，测得Ai；最后在25mL比色管中加入2mL无水乙醇再加入5份不同浓度的石榴皮提取液、VC和提取液+VC，测得Aj。

式中A0：不含提取物液的吸光度；Ai：加入石榴皮提取物液的吸光度；Aj：不含DPPH·的吸光度。

1.2.3.2 清除·OH能力的测定 配制5份不同浓度的石榴皮提取液，取出2mL于试管中，依次加入6mmol·L-1FeSO4溶液2mL，6mmol·L-1H2O22mL，加入6mmol·L-1水杨酸2mL，摇匀，37℃反应30min，在510nm下测吸光度A0；同样的方法，再加入5份不同浓度的石榴皮提取液、VC、提取液+VC，测得Ai；最后在25mL比色管中加入6mmol·L-1FeSO4溶液2mL，6mmol·L-1H2O22mL，5份不同浓度的石榴皮提取液、VC、提取液+VC，测得Aj。

式中A0：不含提取物液的吸光度；Ai：加入石榴皮提取液的吸光度；Aj：不含水杨酸的吸光度。

计算清除率=[（ΔA0-ΔA）/ΔA0]×100%

式中 ΔA0：邻苯三酚自氧化速率；ΔA：加入石榴皮提取液后邻苯三酚自氧化速率。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线绘制

按1.2.2的方法以试剂空白为参比，在510nm下测得不同浓度的芦丁标准溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制的标准曲线，见图1,得到线性回归方程：Y=10.659X+0.0818，R2=0.999,有良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 4种方法提取石榴皮中黄酮类物质的提取率

图2 为4种方法提取石榴皮中黄酮类物质的提取率。

图2 4种方法提取石榴皮中黄酮类物质的提取率Fig.2 Extraction rate of pomegranate flavonoids by four methods

由图2可知，在比较了4种不同方法提取石榴皮中黄酮类物质，4种方法提取物浓度分别为1.87，2.96，4.37，4.73mg·mL-1。结果表明，其提取率由高到低的顺序为：微波法＞超声波法＞酶辅助法＞乙醇提取法。

2.3 抗氧化性测定

2.3.1 石榴皮中黄酮类化合物对DPPH·的清除作用

由图3可知，石榴皮提取液、VC、提取液+VC清除DPPH·自由基，相同浓度下，清除能力大小为：石榴皮提取液+VC＞石榴皮提取物＞VC。各溶液的清除能力都随浓度的增大而增大，而且VC有协同作用。

图3 石榴皮提取物对DPPH·的清除能力Fig.3 Clearing ability of pomegranate extract to the DPPH·

2.3.2 石榴皮中黄酮类化合物对·OH的清除作用

图4 为石榴皮提取物对·OH的消除能力。

图4 石榴皮提取物对·OH的清除能力Fig.4 Clearing ability of extract to the·OH

由图4可知，石榴皮提取液、VC、提取液+VC清除·OH，在相同浓度下，清除能力大小为：石榴皮提取液+VC＞石榴皮提取液＞VC。各溶液的清除能力都随浓度的增大而增大，而且VC有协同作用。

图5 石榴皮提取物对·的清除能力Fig.5 Clearing ability of pomegranate extract to the·

3 结论

本实验分别采用乙醇提取法、酶辅助法、超声波法和微波法4种方法提取石榴皮中黄酮类物质，实验数据表明，微波法提取效率最高，达4.73%，最佳提取条件为料液比1∶25（g∶mL），提取次数为3次，每次2min，提取功率600W，乙醇浓度70%；超声法提取效率次之，达4.37%，最佳提取条件为：料液比1∶20（g∶mL），提取时间25min，提取温度50℃，乙醇浓度60%。

抗氧化剂在药品、化妆品及保健品中具有广阔的市场前景。近年来,在黄酮类化合物抗衰老作用的研究方面,许多科研工作者发现这类活性成分能够延缓神经系统、免疫器官、生殖系统、肝脏和皮肤等组织的衰老[8]。期望为石榴皮作为天然抗氧化剂和功能性食品得到开发利用提供理论基础和实验依据。