抗精神病药干预早期社会隔离小鼠精神分裂样表型的机制研究

李 梅，李白嘉，党永辉，高成阁

（1.西安交通大学第一附属医院精神科，陕西西安 710061；2.西安国际医学中心医院，陕西西安 710100；3.西安交通大学医学部法医学院，陕西西安 710061）

童年时期情感或身体上的不良经历，包括虐待、忽视、创伤等会增加精神病的患病风险[1-2]。目前生命早期不良应激的研究主要集中于动物模型，早期社会隔离模型（social isolation,SI）是最常使用的动物模型。SI对成年后的行为产生重要影响，啮齿类动物可出现抑郁行为、焦虑行为、前脉冲抑制受损、认知功能改变等[3-6]。SI不仅影响行为表型，也显著影响脑内多巴胺、五羟色胺、谷氨酸等神经化学功能[7]。这些改变与精神分裂症具有密切关系。为进一步研究早期SI与精神分裂症的关系，本研究通过建立早期SI模型，并应用非典型抗精神病药利培酮和典型抗精神病药氟哌啶醇对模型进行干预，探究药物对C57小鼠的行为表型及生化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组3周龄C57清洁级小鼠（雄鼠，每组8只，共32只），购自西安交通大学实验动物中心。室温(23±1)℃，湿度55%±5%，光照时间为7：00~19：00。动物自由获取水和食物。适应3 d后，小鼠随机分为群养(group house,GH)组和隔离(social isolation,SI)组，SI小鼠单笼饲养，GH组小鼠3~4只/笼。隔离至8周后，分别等体积腹腔注射生理盐水（normal saline,NS）、利培酮（risperidone,RIS）、氟哌啶醇(haloperidol,HA)。小鼠分为4组：对照组（GH+NS）、模型组（SI+NS）、利培酮干预组（SI+RIS）、氟哌啶醇干预组（SI+HA）。对照组与模型组结果对比可预测模型是否建立成功，干预组与模型组结果对比则可预测利培酮和氟哌啶醇的干预效果。利培酮和氟哌啶醇的剂量分别为0.1、0.2 mg/kg。连续干预14 d后，进行行为学测试，期间给药不间断。与实验鼠周龄、体质量相当的CD1雄鼠16只，用于社会互动测试（social interaction test,SIT）中的陌生鼠。

1.2 行为学实验

1.2.1旷场实验（open field test,OFT）装置为一个正方体（45 cm×45 cm×45 cm）的黑色敞箱。实验时，适应测试环境后使小鼠自由探索1 h。用电脑自动控制下的视频追踪系统（SMART，Panlab SL，Barcelona，Spain）监测动物的自主活动。评价小鼠的自主活动能力和焦虑样行为。

1.2.2高架十字迷宫实验(elevated plus maze test,EPMT)装置包括两个交叉的开臂（25 cm×5 cm）和两个上部敞开的闭臂（25 cm×5 cm×20 cm），中心为正方形的开阔平台（5 cm×5 cm）。实验时将小鼠面对开臂置于中央平台，分别记录5 min内小鼠进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间，计算百分比，以此作为评价焦虑的指标。

1.2.3强迫游泳实验(forced swimming test,FST)装置为一透明有机玻璃桶（直径25 cm×高15 cm），水温恒定（22±1）℃，水深10 cm，小鼠后爪和尾不能触及水底。将小鼠放入水中，记录小鼠6 min的累计漂浮不动时间。评价小鼠的抑郁样行为。

1.2.4筑巢实验(nest building test,NST)测试前一天将每只小鼠单笼饲养，适应24 h。当日18：00，即黑暗期之前1 h，将小鼠转移至一个新笼子里，底部平铺(10±1)g的干净垫料，笼子一侧放置5 g脱脂棉球作为筑巢材料。整个实验中将笼子保持在房间原有的位置。次日上午8时，由未参加测试的5人盲评每只小鼠筑巢分数，以代表SI组小鼠和GH组小鼠的筑巢能力。评分等级如下。0分：棉球未被移动；1分：棉球散落在笼子四处，但没有明显的撕咬痕迹；2分：棉球主要集中在笼子的一角，但没有明显的咬痕；3分：棉球主要集中在笼子一角且有明显撕咬痕迹，但没有可见的巢；4分：棉球主要集中在笼子一角且有明显撕咬痕迹，同时可见明显的巢。评价小鼠的社会退缩行为。

1.2.5社会互动测试（social interaction test,SIT）测试前，雄性原住小鼠在测试笼中单独饲养2 d，测试时另外放入一只CD1陌生小鼠5 min，记录行为反应，包括：①社会交往行为，如紧随（close following）、审视（inspection）、嗅闻生殖器（anogenital sniffing）等；②逃避行为（主动回避另一只小鼠）；③攻击行为（撕咬、扭打、抖动尾巴）。评价小鼠的社会活动行为。

1.2.6新异物体辨别实验(novel object recognition test,NORT)实验装置为一敞箱（30 cm×30 cm×35 cm），底部覆盖饲养垫料。适应阶段（Day1）：小鼠自由探索装置10 min。训练阶段（Day2）：将两个形状、颜色不同但大小相近的物体对称固定于敞箱底部中心，允许小鼠探索10 min，记录小鼠探究每一新异物体（面对、触或嗅）的时间；1 h后，换掉其中一个物体，将动物再次放入测试箱自由探索5 min，记录小鼠探究每个新异物体的时间，以此评价小鼠的认知能力。

1.2.7前脉冲抑制实验(prepulse inhibition,PPI)实验仪器为震惊反射系统（Startle Reflex，Med Asso⁃ciates Inc,USA）。实验开始前，小鼠在实验装置内适应5 min。背景声音是68 dB，共86个试验。8种试验类型，分别是单独的惊反射刺激（pulse-alone,120 dB，持续40 ms）、3种单独的前脉冲刺激（prepulse-alone，分别高于背景声音3、6、12 dB，持续20 ms）、3种前两类刺激联合的试验（pulse+prepulse，二者间隔100 ms）和只给予背景声音的无刺激试验（no stimulus）。这8种类型的试验以假随机的方式出现,每种试验呈现10次，每个试验间的平均间隔为15 s（8~22 s）。此外，整个测试开始有6个单独的惊反射刺激（结果不纳入分析），用以将动物的初始反应降低到一个平台水平。评价小鼠感觉门控系统功能。

1.3 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immuno⁃sorbent assay,ELISA)实验采用双抗一步夹心法，预包被抗体的微孔中，依次加入标本、标准品，标记HRP的抗体。经过温浴后，彻底洗涤。底物TMB显色，在过氧化物酶的作用下催化为蓝色，随后酸化后变为黄色。颜色深浅与样本的浓度呈正相关。利用酶标仪设定450 nm波长，测定吸光度值（A值），计算样本浓度。检测脑组织中D2R、NR1的表达。

1.4 统计学分析应用SPSS statistics 24.0进行分析。实验数据均以均数±标准差（SD）表示。实验数据经正态性检验及方差齐性检验，应用单因素方差分析（One-way ANOVA），多组间比较应用最小显著性差异法LSD(least-significant difference)进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 行为学结果

2.1.1对自主活动和焦虑-抑郁样行为的作用在OFT中，4组小鼠的总活动距离没有差异（图1A）。与GH组相比，SI组小鼠中心区域活动距离明显减少；与SI组相比，SI+RIS组小鼠中心区域活动距离明显增加（P＜0.05，图1B）。

图1 OFT结果Fig.1 OFT results

在EPMT中，与GH组比较，SI组小鼠进入开臂的次数明显减少（P＜0.05，图2A）。与SI组比较，SI+RIS组小鼠进入开臂的次数明显增加（P＜0.05，图2A），SI+RIS组在开臂中的时间明显增加（P＜0.05，图2C）。与SI+RIS组相比，SI和SI+HA组小鼠在闭臂停留时间明显增加（P＜0.05，图2D）。

在FST中，SI组小鼠首次出现不动行为的潜伏时间明显低于SI+RIS组小鼠（P＜0.05，图2E）；与GH组比较，SI组小鼠的后4 min不动时间均明显增加（P＜0.05，图2F）。

同时与SI组比较，SI+RIS和SI+HA组小鼠 的后4 min不动时间均明显减少（P＜0.05，图2F）。

2.1.2对筑巢能力和社会行为的作用NBT中，与GH组比较，SI组小鼠的筑巢能力明显下降。而SI+RIS组小鼠的筑巢能力明显高于SI组（P＜0.05，图3A）。SIT实验中，与GH组比较，SI组和SI+HA组的社会互动行为和逃避行为明显下降（P＜0.05，图3B、图3C）。4组小鼠的攻击行为无统计学差异（图3D）。

2.1.3对认知能力的作用NORT中，各组小鼠对物体的偏好无统计学差异（图3E、图3F）。

图2情绪相关行为结果Fig.2 Emotional-related behavioral outcomes

2.1.4对PPI的作用PPI实验中，与GH组相比，SI组小鼠的PPI指数明显降低；SI+RIS组和SI+HA组 小 鼠 的PPI指 数 明 显 高 于SI组（P＜0.05，图4A）。

图4 PPI实验结果Fig.4 PPI experimental results

2.2 对PFC、NAc中D2R和NR1的作用与GH组比较，模型组SI的NR1在PFC中明显下降（P＜0.05，图5B），D2R在NAc中明显升高（P＜0.05，图5C）。利培酮和氟哌啶醇干预后，SI+RIS和SI+HA组小鼠NAc中的D2R浓度降低（P＜0.05，图5C），PFC中的NR1浓度与SI组的统计学差异消失。

图5 D2R和NR1表达 结果Fig.5 Expressions of D2R and NR1

3 讨 论

精神分裂症是一组病因未明的重性精神病，临床上往往表现为症状各异的综合征，涉及感知觉、思维、情感和行为等多方面的障碍，以及精神活动的不协调[8]。其发病机制迄今尚不明确。多巴胺2型受体（dopamine type 2 receptor,D2R）和谷氨酸N-甲基天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate acid receptor,NMDAR）的功能失调占据主流学说，受到科研工作者的关注[9-10]。典型的抗精神病药包括氟哌啶醇等，具有多巴胺功能拮抗作用，便支持此学说。利培酮作为非典型抗精神病药，不仅具有D2R拮抗作用，也与5-HT2受体具有较高的亲和力，临床上不良反应更小。本研究利用SI模型，从情绪、认知、社会行为、感觉门控等方面，全面探讨利培酮和氟哌啶醇干预SI的不同机制。

3.1 利培酮与氟哌啶醇相比，能更好地改善SI引起的精神分裂样行为表型本研究中，SI小鼠与对照组相比，表现精神分裂样行为表型，模型建立成功。首先，SI组小鼠出现情绪异常。OFT的中心区域活动距离、EPMT、FST均可有效评价动物的情绪行为。本研究表明，利培酮可以缓解SI引起的焦虑和抑郁样行为，氟哌啶醇只能减少抑郁样行为。其次，SI小鼠的筑巢能力、社会交往行为明显减少，出现社会退缩。筑巢行为是小鼠的本能行为，具有社会交流性质，筑巢能力的受损表明小鼠社会功能损伤，这与LI等[11]研究结果相同。SIT是从小鼠不同的行为表现评价其社会交往、逃避及攻击行为，只有利培酮对社会行为有较好的干预结果。SI小鼠在NORT中并未表现出认知功能改变，与Morris水迷宫中SI小鼠空间记忆能力下降结果不一致，这可能与评价认知功能所采用的测量方法不同有关[12]。但SI小鼠的PPI认知功能下降。PPI被认为是一种跨种系的感觉运动门控模型，可以作为一种注意前的感觉门控测量方法，感觉门控功能的缺失与精神分裂症患者所表现出的认知混乱和思维异常有密切的关系[13-14]。因此，感觉门控功能缺失可用于间接评价精神分裂症。基于神经发育学说的SI模型使小鼠表现出精神分裂症相关的行为表型，这表明SI作为精神分裂症模型,具有较好的结构效度、表面效度和预测效度，相比氟哌啶醇，利培酮能更好地改善焦虑样行为、社会退缩、社会互动行为和逃避行为。

图3社会行为和认知行为结果Fig.3 Results of social behavior and cognitive behavior

3.2 利培酮和氟哌啶醇影响SI引起的D2R、NR1表达异常在本研究中，早期SI应激的小鼠，其PFC中NR1表达下降，NAc中D2R的表达升高，这与现有的精神分裂症的主流假说相一致，即皮质NMDA受体功能下降，而皮质下边缘系统D2R功能活跃[9-10]。利培酮和氟哌啶醇干预后，SI+HA小鼠中D2R表达与SI组比较明显降低，NR1的表达虽未出现改变，但相对于GH组的明显差异消失。现有动物研究显示，早期SI能引起DA系统浓度和功能的改变，这种改变主要发生在PFC、NAc和杏仁核[15-16]。这与本研究发现的SI小鼠出现NAc中D2R的表达上调一致。IERA⁃CI等[4]发现，社会隔离小鼠前额叶皮层mGluR1和mGluR2的水平选择性下降。另有研究发现，社会隔离26 d后，大鼠内侧前额叶mGluR6和AMPA3型谷氨酸受体亚基增加[17]。本研究中SI小鼠PFC中NR1的表达下调，并表现出类似情绪障碍。SI小鼠的行为表型异常与脑内D2R、NR1的表达异常相关。

利培酮和氟哌啶醇显著影响D2R表达，对NR1表达也有一定影响。有学者认为，精神分裂症的发生是源于D2R调节作用于NMDA受体的谷氨酸释放状况而造成谷氨酸NMDA受体功能减退的结果[18]。他们认为是遗传性的DA系统异常带来谷氨酸分泌的超抑制，引起NMDA受体功能减退，进而形成精神病性症状。因而一旦给予精神分裂症患者D2R阻滞剂时，则可恢复正常的谷氨酸分泌，解除其NMDA受体功能减退状态而使精神症状得到控制（这也可能是D2R阻滞剂治疗精神病性症状的疗效机制所在）[19]。多巴胺受体与NMDA受体相互作用，在人类皮层和啮齿动物纹状体中D1受体介导NMDAR反应的增强[20-21]，这种调节在伏隔核、前额皮层等大脑其他结构也得到证实[22-23]。同时在海马CA1锥体神经元，D2R抑制NMDA受体介导的兴奋传导，这可能是通过激活Ca2+通道，引起细胞内Ca2+增加，Ca2+内流减少，NMDAR应答减弱[24]；前额叶皮层神经元也发现D2R抑制NMDA受体介导的下游活性[25]。因此，利培酮和氟哌啶醇在抑制D2R发挥抗精神病作用时，可能也影响着NMDA受体的功能。

综上所述，相比氟哌啶醇，利培酮能更好地干预SI诱导的精神分裂样行为，同时这可能是通过D2R、NR1发挥作用。