肌萎缩侧索硬化的生物标志物研究进展

周青青，刘 潇，贾 蕊，党静霞

（西安交通大学第一附属医院神经内科，陕西西安 710061）

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种病因不详、发病后进展迅速而又缺乏有效治疗手段的严重致死性神经系统变性疾病，是运动神经元疾病中最常见和最严重的类型[1]。目前本病缺乏有效的治疗措施，FDA批准的利鲁唑和依达拉奉仅能延长患者数月的生存期，并不能有效阻止疾病进展。遗传学、生物标志物等的研究进展为本病的早期诊断、预后评估提供了依据。本文重点介绍ALS的生物标志物研究进展。

1 基因组生物标志物：识别ALS的遗传基础

每一个基因变化本身都代表着一种新的基因生物标志物，可以用于临床诊断。目前，全基因组关联研究（GWAS）和全外显子测序（WES）是用于鉴定/筛选与ALS相关的新致病性变体的两个主要方式。其中致病基因可直接导致疾病发生或进展，而疾病修饰基因的突变将影响ALS疾病的发生或进展。这些基因的发现为深入探讨疾病的发病机制及精准诊断和治疗提供了基础。

1.1 致病基因自1993年第一个ALS致病基因SOD1的发现开始[2]，目前已有20~30个相关基因明确与ALS的发病机制相关。这些基因代表当前诊断过程中最常见的基因突变，包括FUS、SQSTM1和TARDBP基 因[3]。2011年 发 现 的C9ORF72是 高 加索人群中ALS患者最常见的基因突变，以及后续发现的一些少见的基因类型，包括VCP、VAPB、SORT1、UBQLN2和FIG4等。主要涉及的生物学功能包括蛋白质质量控制与稳态、RNA稳定性、DNA损伤与修复、自噬的调制失衡、神经元轴突细胞骨架动力学改变等[4]。近年来识别的ALS多个相关新基因为ALS的发病机制等研究提供了新的方向和证据。TBK1突变与ALS的异常细胞清除有关，在TBK1相关的ALS患者及脊髓病理中均发现TDP-43阳性包涵体，TBK1-ALS可看作是另一种“TDP-43蛋白病”[5]。CHCHD10突变进一步提示ALS患者线粒体功能障碍[6]。KIF5A在ALS中的发现强调了细胞骨架缺陷在ALS发病机制中的重要性[7]。编码微管相关蛋白的TUBA4A基因在ALS中的发现，进一步提示细胞骨架结构动力学在ALS发病机制中的作用[8]。CCNF突变发现于欧洲的一个ALS家族中，编码细胞周期蛋白F，提示异常蛋白泛素化和可能的异常细胞周期再进入是ALS中神经元丢失的机制[9]。由于这些基因突变发现较晚，且并非常见的突变，其具体作用机制及临床表现还需进一步确认。

ALS的临床表型与基因突变类型具有相关性，如SOD1A4V和C9ORF72突变的患者生存期短、进展快，SOD1H46R和SOD1D90A突变的患者生存期长，FUSP525L突变患者的发病年龄通常较早、进展快，C9ORF72突变患者多合并认知功能损害等。C9ORF72六核苷酸基因扩张与ALS及额颞叶痴呆(FTD)均有关系[10]。因此，遗传生物学标志物有助于患者的分层和精确用药。

1.2 疾病修饰基因遗传分析也可以通过分析疾病修饰基因来帮助预测疾病的进展。GWAS研究提供了影响ALS表型的基因数据，其中EPHA4和CX3CR1的研究最为广泛[11]。EPHA4功能缺失性变异可显著延长ALS患者的生存期。与生理性CX3CR1V249V等位基因相比，I/I及V/I等位基因携带者的生存期约缩短25个月[12]。此外，CAMTA1的SNP rs2412208和rs139550538等位基因使ALS患者的生存期延长了4~8个 月[13]。KCNJ11的rs5219位 点 可 使 延 髓 型ALS患者的生存期延长。KCNJ11的基因产物是ATP敏感性钾通道的一个组成部分，因此它不仅可用于诊断，而且未来可用于进行治疗策略的开发[14]。药物基因组学研究发现，某些SNPs影响了患者对药物的疗效，如携带UNC13A基因rs12608932风险等位基因的ALS患者服用碳酸锂后，随访12个月的患者死亡率明显低于不携带风险等位基因组患者[15]。因此，制定针对特定人种ALS的致病基因筛查策略对于疾病的精准诊断、疾病进展及预后的评估、药物使用的指导具有重要意义。

2 蛋白质生物标志物

蛋白质是常规临床分析最理想的生物标志物。由于其通常在血液等生物流体中稳定分泌，且可用酶联免疫吸附实验（ELISA）等免疫分析法或基于质谱的方法进行检测，因此基于蛋白质的生物标志物已被用于ALS的诊断和分层研究。由于组织活检难以用于神经退行性疾病的诊断，因此包括血液和脑脊液（CSF）在内的生物流体是最受关注的用于识别ALS的候选生物标志物[16]。

2.1 神经丝蛋白（NFs）NFs是目前研究最为广泛的ALS蛋白质生物标志物。NFs是由4个亚单位组成的中间丝，包括神经丝重链（NFH）、中链（NFM）、轻链（NFL）和中枢神经系统中的α-交联蛋白（α-nternexin）。后者在周围神经系统中被外周蛋白取代。它们经过了多种翻译后修饰，其中最重要的是磷酸化修饰[17]。其中研究最多的是磷酸化的NFH（pNFH）和NFL。大量证据支持神经丝水平作为ALS诊断要素。有研究表明，与对照组相比，ALS患者CSF中NFL和pNFH升高，诊断敏感性和特异性＞80%，它们也与疾病进展率和生存率相关。血清和CSF的NFL之 间 有 很 高的相关性[18]。CSF的NFL与疾病亚型相关，当上运动神经元负荷增加或疾病进展速度更快时，基线水平更高，而与患者年龄无关。此外，与健康对照组相比，ALS患者的血NFL水平明显升高，高初始NFL水平是生存率的一个强有力的独立预测因子，而随着疾病的进展，NFL的水平变化不明显，因此NFL似乎可作为诊断和预后的标志物，而不是疾病进展的标志物[19]。多项研究已经阐述了NFL和pNFH蛋白在CSF和血液中作为ALS潜在生物标志物的作用[20]。NFL和pNFH是轴突损伤的标志物，可直接反映出神经元的健康状况[21]。而NFL对ALS的特异性较低，因为额颞叶痴呆（FTD）、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)和吉兰-巴雷综合征（GBS）患者中均可见NFL的升高。因此，CSF中的pNFH是一种更好的生物标志物，可更好鉴别ALS与其类似疾病。

2.2 聚-二肽C9ORF72基因中的六核苷酸GGGGCC重复扩增是ALS中最常见的致病性突变。通常，C9ORF72基因在第一个内含子中包含大约30个GGGGCC重复，但是在ALS携带者中，这些重复可达成百上千次。从变异体C9ORF72基因转录的RNA被一种称为重复相关非ATG翻译（RAN）机制翻译，产生5种不同的多肽：GA聚集体、GR聚集体、GP聚 集 体、PR聚 集 体和PA聚 集 体，在5种 聚 二 肽中，含有精氨酸的GR聚集体和PR聚集体比其他类型毒性更大[22]。据报道，GR聚集体或PR聚集体在体内和体外均能诱导细胞毒性。GR聚集体或PR聚集体在人星形胶质细胞中通过损害pre-mRNA的剪接或核糖体RNA成熟或通过内质网应激诱导细胞死亡。GA聚集体可通过抑制蛋白酶体诱导内质网应激[23]。这些多肽在细胞中积累并在C9ORF72突变携带者的CSF中已有发现[24]。由于体细胞不稳定，通常用于遗传分析的血细胞很可能不会发生这种异常的多肽聚集体，而神经细胞则会出现。因此，将基因检测与多肽类检测结合起来，有望对临床诊断有更多的帮助。

2.3 TDP-43TDP-43是一种核蛋白，一般情况下不会在细胞质中发现。生理条件下，TDP-43主要在细胞核内，可在细胞核和细胞质之间穿梭，少量TDP-43可转运到线粒体。当TDP-43突变发生时，或在一定的细胞应激下，可转移到细胞质中，进而被过度磷酸化和聚集，在神经元及神经胶质细胞中形成泛素阳性聚集物，引起神经系统病变，其具体机制尚不明确[25]。在超过97%的ALS病例中发现由TDP-43组成的聚集体，其他大多是由携带SOD1或FUS致病性突变导致的SOD1或FUS蛋白聚集引起的ALS类型。因此，TDP-43聚集物或TDP-43异常形态的存在可作为一种通用的ALS生物标志物[26]。最近有研究发现了可针对不同的TDP-43变异体的单链抗体，该研究也表明存在疾病特异性TDP-43变异体。也就是说，与ALS患者相比，存在C9ORF72基因突变的个体血浆中具有不同的TDP-43形式。因此，这些抗体不仅有助于ALS的诊断，而且有助于将患者分为不同亚型[27]。CSF中TDP-43的测定可用于ALS与帕金森病（PD）、多发性硬化症（MS）和GBS的鉴别诊断[28]。

2.4 其他蛋白质胱抑素C（CysC）是一种内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可通过刺激自噬和抑制组织蛋白酶B的神经毒性以保护运动神经元免受损伤，在中枢神经系统调节细胞外蛋白稳态中起着重要作用[29]。ALS患 者 的CSF减 少，CSF中CysC蛋 白 水 平与ALS患者的生存率呈正相关，因此有可能作为预后的一种生物标志物[30]。有研究鉴定了CysC对SOD1突变介导的ALS毒性的神经保护作用，外源性添加的CysC可保护神经元，包括原代培养的运动神经元[29]。CysC是一种内源性神经保护剂，针对运动神经元的CysC可能为ALS提供一种新的治疗策略[31]。

转甲状腺素蛋白（TTR）是一种高度保守的同四聚体蛋白，主要在脉络丛和肝脏细胞中合成，并分别分泌到CSF或血浆中[32]。TTR也在神经元中产生，可参与神经发生、神经修复和轴突生长。数项研究表明TTR在ALS中持续 下降，ALS脊髓中TTR水平的降低可能是由于运动神经元数量和剩余运动神经元中TTR表达水平降低所致[33]。与健康对照组相比，尸检发现ALS患者的CSF中TTR水平降低，表明ALS的CSF中TTR谱峰的降低在疾病过程的早期发生，并持续发生于整个疾病过程中。可以假设ALS运动神经元的低TTR水平可降低其神经保护功能，从而更容易受到神经变性损伤。这一假设值得进一步探讨[34]。

C3是血清中含量最高的补体成分，主要由巨噬细胞和肝脏合成，在C3转化酶的作用下，裂解成C3a和C3b两个片段，后受血清中I因子、H因子和蛋白酶的作用，又可逐级水解为C3b、C3f、C3c和C3dg，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。ALS患者血清和CSF中补体组分C3和C4的活化片段增加。ALS患者脊髓和运动皮质的胶质细胞也有这些片段的升高。据此推测，ALS患者CSF中C3c的高水平不仅是由于通过血脑屏障的渗漏，而且是由于C3组分与特异性脑损伤的中枢神经系统淋巴细胞上的受体结合减少所致[35]。

C反应蛋白（CRP）是一种由促炎细胞因子调节的急性期蛋白，在炎症反应过程中由肝细胞分泌。CRP是炎症反应的生物标志物，对多种肿瘤有重要的预后预测价值。目前的研究显示，ALS患者血清CRP水平较高者比CRP水平较低者进展更迅速。此外，血清CRP水平与ALSSRs-R评分呈显著负相关，表明血清CRP水平是ALS患者有用、可行和预后的重要因素[36]。

此外，与健康对照组相比，ALS患者血清白蛋白降低。ALS患者血清白蛋白水平降低可能是由炎症状态引起的[37]。ALS患者血浆中铁蛋白的增加，提示在ALS患者的血浆和血清中存在氧化应激的铁调节异常[38]。

一项深入研究表明，在以上的蛋白质标志物中，C9ORF72和TDP-43中 由GGGGCC扩增 而来的神经丝、聚-二肽是诊断ALS最有前景的蛋白质生物标志物[16]。

3 代谢物

对循环代谢物分析的多数研究显示，ALS患者血清和血浆中的特定代谢物普遍有上调的趋势，这与ALS患者的高代谢相一致，但不同研究间存在较大差异。例如，与细胞能量代谢相关的肌酸在CSF和血浆中持续升高[39]。在ALS患者中也发现，CSF和血浆中丙酮酸和葡萄糖含量增加，这可能反映了在一些ALS患者中观察到的糖酵解代谢失调。糖酵解上调与较短的生存时间相关，因此可以作为一种预后生物标志物[40]。同样，在CSF和血浆中观察到的胆固醇和LDL的上调也反映了ALS患者脂质代谢的整体失调[41]。其他如同型半胱氨酸等神经毒性代谢物在所有体液中持续增加[42]。另有研究证实了鞘脂下调和糖基神经酰胺上调，表明ALS患者能量代谢的全面失调[43]。此外，肌酐和棕榈酰鞘磷脂与线粒体功能有关，这些生物标志物在ALS血浆中升高，与ALSFRS-R评分呈负相关[44]。在横断面研究中，ALS患者血清尿酸水平较健康对照组降低[45]。尿酸作为一种强大的抗氧化剂，有助于对抗ALS中的氧化应激[46]。血清尿酸、肌酐、白蛋白和总蛋白水平的降低发生在疾病早期，表明这些基于代谢物的生物标志物的早期变化可能与疾病的病理生理进展有关，而不是ALS患者营养不良的结果[47]。

4 未来ALS诊断的其他生物标志物

除了上述生物标志物可能有助于临床诊断ALS外，还有一些其他措施可用于ALS诊断，但均处于研究初期。

4.1 皮肤活检外胚层皮肤和神经组织有共同的胚胎起源，这可能是许多神经退行性疾病伴随皮肤变化的原因[48]。更重要的是，皮肤的变化先于神经症状的出现。19世纪CHARCOT首次报道了ALS患者的皮肤变化，包括胶原纤维直径和密度以及胶原和弹性蛋白交联的变化[48]。已发现在ALS患者皮肤中有几种蛋白表达错误，但皮肤结构的变化尚不能完全与ALS联系在一起，因此目前不具有诊断潜力。然而，多数ALS患者中可发现TDP-43沉积物。TDP-43具有核定位信号，主要存在于核内。在ALS患者死亡后的脑组织中观察到TDP-43胞质沉积[49]。而由于获取用于分析的大脑或脊髓标本的操作具有侵入性，其在诊断中的应用有限。因此，皮肤活检的应用值得进一步研究。表皮细胞表达TDP-43增加的原因目前尚不清楚，但可能是由于神经细胞和表皮细胞之间的TDP-43异常增殖，其机制类似朊病毒。

4.2 尿液标志物有研究显示，与健康个体或PD及MS患者相比，ALS患者尿液中的神经营养素受体p75ECD浓度显著升高，而快速进展的ALS患者的尿液中p75ECD浓度更高[50]。在一个中国队列研究中也证实了这一观点。该研究对101名ALS患者、108名PD和MS等其他神经系统疾病患者和97名健康对照者进行了尿液分析，结果显示，ALS组的p75ECD较其他组升高，较高的p75ECD水平也与临床分期的增加相关[51]。此外，与对照野生型小鼠相比，SOD1-G93A小鼠尿液中的p75ECD浓度更高；而且在症状出现之前已经出现增高。尿液p75ECD可作为预测ALS疾病进展及评估疾病严重程度的标记。

4.3 非编码RNA越来越多的研究发现，非编码RNA（ncRNA）（小于100个核苷酸RNA）可作为潜在的 生 物 标 志 物，包 括tRNA、rRNA、piwi-RNA和miRNA。在充分了解其生物发生和功能的基础上，miRNA已成为大多数研究的主要焦点。已有研究表明，miRNAs在ALS患者和健康对照者的CSF、血清等体液中表达存在差异[52]。而最近的研究显示，使用RT-qPCR测定的2个小RNA表达的比值，与使用单个小RNA相比，提高了鉴定ALS病例的敏感性和特异 性，如miR206/miR338-3P、miR9/miR129-3P和miR335-5P/miR338-3P这3对小RNA组合能够更清楚地区分ALS患者和对照组患者，其敏感性为84%，特异性为82%[53]。这提示用1个以上的小RNA作为ALS的“生物标志物”是可取的。

也有可作为ALS中的生物标志物的其他类型分子的研究，例如长非编码RNA（lncRNA），可顺式作用于沉默或增强近端基因的表达，并且已知其在正常神经元发育以及神经退行性疾病的发生和进展中具有关键作用。在体液中也检测到lncRNA，且已被认为是肺癌、三阴性乳腺癌和心血管疾病的潜在诊断和/或预后生物标志物。因此，lncRNA可作为包括ALS的神经退行性疾病的候选新生物标志物[54]。

鉴于ALS患者生存和残疾的异质性较大，早期准确诊断ALS很可能需要一组生物标志物，而不是单一的某一个生物标志物，以更有效地诊断ALS。大多数诊断性生物标志物的相关研究将患者与健康对照组进行对比。此外，通过替代生物标志物以评估疾病如何随时间变化的纵向研究，将能够为ALS的亚型及其预后提供更多的信息。未来的生物标志物研究应包含所有表型数据以及遗传和生物信息，以帮助分层。

5 结 论

ALS相关标志物的研究是为了给ALS患者提供更好的诊断和治疗措施，尽早诊断可尽早启动神经保护治疗以延缓疾病进展。另外，能够监测疾病进展的标志物也有利于判断疾病的严重程度，同时在ALS药物实验研究中评估治疗效果，对于ALS治疗新药物的研发有重大意义。此外，单一标志物的作用有限，未来需要联合应用生化和遗传学等方面的证据，从而为ALS患者的诊断和治疗提供更有价值的依据。