凝结芽孢杆菌BC66对团头鲂脏器组织形态及血清生化指标的影响

向 阳， 胡 鲲*， 方曙光， 朱建国， 柯 轲， 陈 献

（1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海201306；2.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海201306；3.上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；4.微康益生菌（苏州）股份有限公司，江苏苏州215200；5.苏州宏鳌生物农业发展有限公司，江苏苏州215200）

随着水产养殖规模、集约化程度不断提高，水产动物病害问题也日趋严重。据统计，2019年我国因病害造成的水产品损失高达408亿元（崔利锋，2020）。加之抗生素耐药性和化学药物污染等问题日益凸显（李炳等，2020；Wu等，2019），利用益生菌防治水产动物疾病、减少经济损失已然成为水产养殖从业人员和研究学者关注的焦点。益生菌可通过定植在水产动物肠道，改善其肠道微生态环境，优化肠道菌群，从而发挥其有效作用（张美玲等，2021）。目前，芽孢杆菌类的益生菌在促进水产动物生长、增强机体免疫以及改良水质等方面的研究已取得良好进展（吴豪益等，2021）。

凝结芽孢杆菌是一类既具有产乳酸特性，又同其他芽孢杆菌一样具有耐高温特性，兼性厌氧的革兰氏阳性菌（邹梅等，2017）。自2013年被正式列入《饲料添加剂品种目录》以来，凝结芽孢杆菌已作为益生菌广泛应用于畜禽水产等行业，饲料中添加凝结芽孢杆菌可提高饲料养分的利用率（Fu等，2021），促进其蛋白质和脂类代谢流转（吴正可，2021），提高生长性能和机体抗病力（李佳徽，2021），改善肠道菌群结构。基于此，本研究在团头鲂饲粮中添加凝结芽孢杆菌，观察对其脏器组织形态和血清生化指标的影响，为凝结芽孢杆菌等益生菌在水产养殖上的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 凝结芽孢杆菌制剂BC66（1000 cfu/g）由微康益生菌（苏州）股份有限公司提供，于2020年7～8月在江苏无锡开展。

1.2 试验设计 试验选取体重（26.5±0.5）g的健康团头鲂幼苗180尾，随机分为2组，每组3个重复，每个重复30尾。对照组投喂基础日粮（表1），试验组为基础日粮+0.15‰的凝结芽孢杆菌BC66制剂，试验30 d。试验期间以重复为单位，每天投喂3次。试验期水温控制在26～30℃，pH为7.0～8.0，溶氧保持在5 mg/L以上。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.3 试验方法 解剖取样观察：于试验初期、末期分别在每个重复选3尾鱼解剖，对比观察腹腔及肠道状况，并取完整肠道、肾脏和肝胰脏样本。

将样本用0.65%的生理盐水冲洗肠道内容物，取1～2 cm的前肠和后肠，以10%的甲醛溶液固定备用。另外，再在每个重复分别取3尾，尾静脉取血6 mL，均分为2等份。一份放入抗凝管中，进行血液常规参数测定；另一份血液于8000 r/min、4℃的条件下离心5 min，制备得到的血清于-20℃冻存备用，用于测定血清生化指标。

组织病理切片观察：各组样本经10%甲醛溶液固定24 h后，水洗20 min，再用梯度酒精脱水。脱水后的组织用二甲苯处理至完全透明后，用石蜡浸泡包埋、切片，厚度设置为4～5μm。经HE染色后，用中性树胶封片，在100×10倍光学显微镜下观察。

血液常规参数：采用全自动动物血液细胞分析仪（迈瑞BC-5300VEt）测定血红蛋白浓度（HGB）和红细胞（RBC）、白细胞（WBC）等，所用试剂购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

血清生化指标：采用分析试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）测定谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、总 蛋 白（TP）、白 蛋 白（ALP）、尿 素 氨（BUN）等指标，详细操作根据试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 凝结芽孢杆菌BC66对团头鲂脏器组织形态的影响 试验结果表明，试验组投喂凝结芽孢杆菌后，腹腔充血状况极大改善，肠道壁毛细血管充血现象消失，韧性增强。试验末期试验组腹腔颜色自然，腹腔充血状况消失，肠道韧性强。

进一步对各脏器组织病理切片（100×10）进行对比发现（图1～4，A为对照组，B为试验组），试验组前、后肠道组织更紧密，肠上皮细胞溶解现象明显减少。投喂凝结芽孢杆菌的试验组团头鲂肝脏、肾脏组织紧密性增强，分布更为均匀，体现出更好的代谢及排泄功能。

图1 前肠组织切片（100＊10）

2.2 凝结芽孢杆菌BC66对团头鲂血液常规指标的影响 如表2所示，日粮添加凝结芽孢杆菌BC66后，血红蛋白浓度较试验初期提升了20.6%，较末期对照组提升了12.3%。红细胞数量较试验初期降低了31.3%，比末期对照组高出36.1%。白细胞数量较试验初期提升了41.1%，比末期对照组高出11.5%。

表2 凝结芽孢杆菌BC66对团头鲂血常规指标的影响

2.3 凝结芽孢杆菌BC66对团头鲂血清生化指标的影响 如表3所示，饲喂凝结芽孢杆菌后，总蛋白、白蛋白含量较试验初期分别提升了32.6%、26.0%，尿素氮指标较试验初期降低了28.8%。谷氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶较试验初期分别降低了8.4%、15.0%，碱性磷酸酶指标试验前后基本无变化。

表3 凝结芽孢杆菌对团头鲂血清生化指标的影响

图3 肝脏组织切片（100×10）

图4 肾脏组织切片（100×10）

3 讨论

肠道、肝脏和肾脏分别是动物进行消化、代谢和排泄的主要场所，各组织的形态结构与其生理功能联系紧密。申维维、蒋磊等（2021）研究证实，饲料中添加凝结芽孢杆菌可改善肉鸡肠道形态结构，起到促进生长的作用。在水产养殖应用中，关于凝结芽孢杆菌改善鱼类肠道结构的报道较少见，大多集中在凝结芽孢杆菌对肠道菌群的影响（匡群等，2013）。单金峰等（2019）研究发现，凝结芽孢杆菌可显著增加青虾肠道微生物区系。凝结芽孢杆菌可降低虹鳟肠道变形菌门比例，提升厚壁菌门、拟杆菌门比例。反映出凝结芽孢杆菌在改善水产动物肠道微生物屏障方面有促进作用。正常的肠道微生物屏障对肠绒毛形态结构的维持具有重要作用，可通过排挤有害菌，分泌抑菌素，减少肠上皮损伤。本研究饲喂凝结芽孢杆菌后解剖观察发现，团头鲂腹腔充血状况极大改善，肠道壁毛细血管充血现象消失，韧性增强。肠道组织也更紧密平滑、分布规则，上皮细胞无溶解现象，显示出改善肠道绒毛结构的效果。说明凝结芽孢杆菌在改善肠道表型形态、维护肠道健康方面具有促进作用。

金子博（2018）和付天玺等（2008）研究发现，凝结芽孢杆菌可显著提高鱼体肝胰脏消化酶活性。本研究虽未测定各消化酶活性，但从肝脏、肾脏组织切片可看出，试验组团头鲂肝脏、肾脏组织紧密性增强，分布均匀，腺体更加明显，间接显示出凝结芽孢杆菌能在一定程度上提高肝脏的消化代谢和排泄水平。

血液中白细胞数量与鱼体的健康状况息息相关，本研究中饲喂凝结芽孢杆菌后，团头鲂血液白细胞数量明显上升，末期水平仍高出对照组，说明凝结芽孢杆菌对提高机体免疫力具有一定的作用。但试验组血红蛋白浓度和红细胞数量指标变化明显，这与张维娜等（2015）的研究结果类似，是否与凝结芽孢杆菌使用剂量有关还有待研究。血清总蛋白主要由血清球蛋白和血清白蛋白构成，试验组投喂后总蛋白含量稍有上升，白蛋白含量降低，表明凝结芽孢杆菌对血清球蛋白的生成具有促进作用。谷氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶是衡量肝功能的重要指标。本研究中谷氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶活性较投喂前降低，与张维娜等（2015）的0.3%凝结芽孢杆菌试验组结果类似，进一步证实凝结芽孢杆菌对肝功能起到了一定的促进作用。尿素氮是动物体内蛋白代谢的主要产物之一，投喂凝结芽孢杆菌后试验组尿素氮含量降低，且低于对照组，说明凝结芽孢杆菌能提高团头鲂蛋白利用率，这与吴正可等（2021）的研究结果一致。碱性磷酸酶为生物体内普遍存在并参与生命活动的一种代谢调控酶，本研究试验组碱性磷酸酶活性略有降低，与张维娜等（2015）凝结芽孢杆菌试验组结果类似，但与赵祖艳等（2021）的研究结果相反。这可能与饲料中添加凝结芽孢杆菌的剂量有关。

4 结论

日粮中添加107cfu/g凝结芽孢杆菌BC66可改善团头鲂腹腔充血状况，可增强肠道韧性，提升肝、肾的组织形态，有助于消化代谢和排泄水平提升；可提高血液白细胞总数，促进免疫功能；可降低血清谷氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平，有助于维持肝脏正常功能。