葛根护肝片对慢性酒精性肝损伤大鼠保护作用研究

赵宏宇，王玉，刘新宇，宋莲莲，史顶聪，史保银，邸琳

（吉林省中医药科学院，吉林 长春130012）

根据世界卫生组织（WHO）报道，全球饮酒人群数量高达20亿，其中滥用酒精超过750万人，据统计，临床中有4%~25%的疾病与饮酒有关[1]。肝脏是人体内酒精代谢的最主要器官，90%~95%的酒精均在肝组织中代谢，少量酒精在肾脏和肌肉等其他组织器官中进行代谢[2]。过量摄入酒精会引起酒精性肝损伤（alcohol-induced liver injury,AILI），导致肝组织出现病变，如果不加干预任其长期发展，可能会引发脂肪肝、肝炎、肝硬化甚至肝癌[3]。AILI的机制尚不完全清楚，根据现有研究，乙醇及乙醛的代谢、脂代谢异常、氧化应激损伤、炎症反应以及肝细胞凋亡等在AILI发生和发展过程中都起到关键作用[4]。大量研究表明，很多中药材和食源性天然产物的功能成分可通过调节酒精代谢、抗氧化应激、抗炎症反应、改善脂代谢、抗细胞凋亡和改善肠道菌群等多种途径干预和治疗AILI[5,6]。葛根护肝片是吉林省中医药科学院研发的一款保健食品，由葛根、枳椇子、白芍及甘草等配伍而成，前期实验表明葛根护肝片对急性和亚急性酒精性肝损伤小鼠有明显的保护作用[7]。本研究选用酒精摄入量递增法的慢性酒精性肝损伤大鼠模型作为实验对象，从不同角度研究并验证葛根护肝片对慢性酒精性肝损伤的治疗及干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠[实验动物生产许可证号：SCXK-（辽）2015-0001，75只，体质量150~170g，实验动物质量合格证号：211002300052368]辽宁长生生物技术股份有限公司[试验动物使用许可证号：SYXK（吉）2015-0009，由吉林省中医药科学院实验动物伦理委员会审核通过，符合实验动物伦理委员会规定]；大小鼠颗粒饲料购自北京科奥协力饲料有限公司[饲料生产许可证号：SCXK-（京）2019-0003]。

1.1.2 药物及试剂葛根护肝片由吉林省中医药科学院自制，每1 g含各药材提取物相当于生药材葛根1.28 g、枳椇子1.28 g、白芍0.64 g、甘草0.64 g；无水乙醇（批号：20160602，北京化工厂）；葛根枳椇软胶囊（批号：818021101，威海紫光生物科技开发有限公司）；MDA试剂盒（批号：20191122）、SOD试剂盒（批号：20191120）、总蛋白定量试剂盒（批号：20191120）均购于南京建成生物工程研究所；TG试剂盒（批号：201907152）、TC试剂盒（批号：20190830）、LDL-C试剂盒（批号：2019081202）、TBIL试剂盒（批号：20190926）、ALT试剂盒（批号：20190904）、AST试剂盒（批号：20180725）均购于迪瑞医疗科技股份有限公司；-GST ELISA试剂盒、Arg-1 ELISA试剂盒、PNP ELISA试剂盒、GLDH ELISA试剂盒（批号均为:NOV2019）均购于上海语纯生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

CS-600B型全自动生化分析仪（长春迪瑞实业有限公司）；DNM-9602型酶标仪（北京普朗新技术有限公司）；723可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；HC-3618R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；SSW-600-2S型电热恒温水槽（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；JA2003B型千分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及造模雄性SD大鼠，适应饲养1周后，随机分为6组，分别为正常对照组、模型组和阳性药组，葛根护肝片高、中、低剂量组。每日上午，正常对照组和模型组大鼠灌胃0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，阳性药组大鼠按333.3 mg/kg灌胃葛根枳椇软胶囊内容物的0.5% CMC-Na溶液，葛根护肝片高、中、低剂量组大鼠分别按520.8mg/kg、260.4mg/kg、130.2 mg/kg灌胃葛根护肝片的0.5%CMC-Na溶液，所有大鼠灌胃体积均为10 mL/kg，连续灌胃28 d。除正常对照组大鼠外，其他各组大鼠每日下午灌胃乙醇溶液制备大鼠慢性酒精性肝损伤模型，乙醇灌胃浓度采用分阶段递增方式，第1阶段（第1日至第3日）灌胃30%的乙醇溶液，第2阶段（第4日至第6日）灌胃40%的乙醇溶液，第3阶段（第7日至第21日）灌胃50%的乙醇溶液，第4阶段（第22日至第27日）上午给药后灌胃30%的乙醇溶液，下午灌胃50%的乙醇溶液。各阶段每次乙醇溶液灌胃体积均为10mL/kg，正常对照组大鼠每日下午灌胃与乙醇溶液等量的蒸馏水。

1.3.2 动物处理及指标检测末次灌胃给药后1 h，大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥钠3 mL/kg麻醉，腹主动脉取血，离心取血清保存备用。分离肝脏，摘取肝左叶称重，以肝叶重量10倍体积的生理盐水研磨肝叶，研磨液4℃放置过夜，离心取上清液保存备用；摘取肝右叶，用4%的甲醛固定，制备石蜡切片，HE染色，进行病理组织学检查。

以全自动生化分析仪检测血清中TC、TG、LDL-C和TBIL的含量及GOT、GPT的活力。ELISA法检测血清中-GST、Arg-1、PNP和GLDH的活力。测定10%肝脏研磨液中总蛋白、MDA的含量和SOD的活力。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析处理，各数值用x±S表示。多组间比较采用One-way ANOVA检验，两两比较方差齐采用LSD法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 大鼠一般情况

大鼠在构建慢性酒精性肝损伤模型过程中，表现皮毛枯黄，体重减轻，平时趴卧聚堆，精神萎靡，但进行灌胃等操作时较为暴躁，特别是灌胃乙醇溶液时，反抗强烈。大鼠每日下午灌胃乙醇溶液后15 min出现昏睡，在第3阶段乙醇浓度提高后，部分大鼠灌胃后可达到翻正反射消失的状态。在乙醇溶液灌胃第3阶段，大鼠出现死亡情况，模型组共死亡2只，阳性药组、高剂量组和低剂量组各死亡1只。死亡大鼠死亡前体重减轻严重，经解剖检查发现肝脏充血发黑，疑似肝衰竭导致死亡。

2.2 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝功指标的影响

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血清中ALT的活力和TBIL的含量显著升高（P＜0.01），AST的活力略有升高，无显著性差异（P＞0.05）。与模型组大鼠相比，阳性药组和葛根护肝片高剂量组大鼠ALT的活力明显下降（P＜0.05），葛根护肝片低剂量组大鼠TBIL的含量明显下降（P＜0.05），其他指标未见明显差异。具体结果见表1。

表1 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝功指标的影响Table 1 Effect on index of liver function in Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.3 对慢性酒精性肝损伤大鼠血脂指标的影响

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血清中TC、TG的含量显著升高（P＜0.01），LDL-C的含量明显升高（P＜0.05）。与模型组大鼠相比，阳性药组大鼠血清中TG的含量明显下降（P＜0.05）。葛根护肝片高剂量组大鼠血清中TC的含量显著下降（P＜0.01），TG的含量和LDL-C的含量明显下降（P＜0.05）。葛根护肝片中剂量组大鼠血清中TC的含量和TG的含量明显下降（P＜0.05）。具体结果见表2。

表2 对慢性酒精性肝损伤大鼠血脂指标的影响Table 2 Effect on index of blood lipid in Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.4 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏中的MDA和SOD的影响

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠肝脏中MDA的含量明显升高（P＜0.05），SOD的活力明显降低（P＜0.05）。与模型组大鼠相比，葛根护肝片高剂量组和中剂量组大鼠肝脏中MDA的含量明显降低（P＜0.05）。肝脏SOD的活力方面，各给药组大鼠均 无显著影响（P＞0.05）。具体结果见表3。

表3 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏中MDA和SOD的影响Table 3 Effect on MDA and SOD in liver of Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.5 对慢性酒精性肝损伤大鼠早期肝损伤指标的影响

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血清中PNP、-GST、GLDH和Arg-1的活力均显著升高（P＜0.01）。与模型组大鼠相比，阳性药组大鼠血清中GLDH的活力明显下降（P＜0.05）。葛根护肝片高剂量组大鼠血清中PNP、-GST、GLDH和Arg-1的活力均明显下降（P＜0.05），葛根护肝片中剂量组大鼠血清中GLDH的活力明显下降（P＜0.05）。具体结果见表4。

表4 对慢性酒精性肝损伤大鼠早期肝损伤指标的影响Table 4 Effect on index of early liver injury in Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.6 对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理的影响

正常对照组大鼠（图1 a）的肝内可见多个肝小叶，肝索及肝窦排列整齐，汇管区3种管道结构清楚可见，无明显异常，呈正常肝组织结构。模型组部分大鼠（图1b）肝细胞发生气球样变性为主，部分大鼠可见肝细胞脂肪变性，2只动物可见肝细胞轻微点状坏死；比较正常对照组，模型组肝细胞损伤模型成立。阳性药组大鼠（图1 c）肝细胞可见脂肪变性，肝细胞疏松变性，肝细胞未见点状坏死，未见炎细胞浸润；比较模型组，阳性药组肝损伤程度减轻，有效缓解肝细胞损伤变性。葛根护肝片高剂量组大鼠（图1 d）肝细胞脂肪变性的程度减轻，肝细胞以疏松变性为主，未见肝细胞坏死，未见炎细胞浸润；比较模型组，葛根护肝片高剂量组可以有效减轻肝损伤的程度。葛根护肝片中剂量组大鼠（图1e）肝细胞气球样变的程度得到有效减轻，肝细胞以疏松变性为主，少见肝细胞坏死，未见炎细胞浸润；比较模型组，葛根护肝片中剂量组可以有效减轻肝损伤的程度。葛根护肝片低剂量组大鼠（图1 f）肝细胞损伤程度得到有效的减轻，可见肝细胞以疏松变性，少见肝细胞脂肪变性，未见炎细胞浸润；比较模型组，葛根护肝片低剂量组可以有效减轻肝损伤的程度。

图1 各组大鼠肝组织形态的比较（HE 400）Fig.1 Comparison of liver histology in rats from each group(HE400)

3 讨论

大鼠在酒精耐受能力方面差异很大，这方面可能与东亚人对酒精的耐受差异情况相似（部分东亚人乙醛脱氢酶2型突变导致不耐受酒精），部分大鼠长期服用浓度为50%的酒精后无明显不良反应，体重外观和正常对照组大鼠几乎无异，而一些大鼠会出现肝衰竭死亡，因此，在制备慢性酒精性肝损伤大鼠模型时，保证尽可能高的酒精摄入量，同时确保较高的大鼠存活率至关重要。本研究选用的模型制备方法是酒精摄入量递增法，该法主要借鉴酒精性肝损伤动物模型制备规范（草案）[8]，并根据实验室经验做出了一些调整。与制备慢性酒精性肝损伤大鼠模型常用的酒精摄入量恒量法相比，酒精摄入量递增法在大鼠耐受性和体重外观方面都有一定的优势，死亡率也较低，而且可以长期维持50%浓度10 mL/kg的酒精灌胃量，甚至在最后1周能耐受上、下午两次灌胃酒精溶液，对慢性酒精性肝损伤模型的成功制备提供了保证。

本研究中大鼠长期灌胃乙醇后，血清中的ALT明显升高，AST无明显变化。ALT主要存在于肝细胞胞浆中，AST多数存在于肝细胞线粒体中。因此ALT作为肝损伤指标相比AST更为敏感，在肝细胞膜损伤阶段即可发现，但同时也说明长期饮酒并不能对大鼠肝脏造成严重损伤。在之前的研究中[7]，小鼠长期用30%的乙醇灌胃后血清中ALT、AST的活力皆无明显变化，但肝脏中的GSH明显升高了，这与普遍认为的饮酒后肝脏中GSH的耗竭理论正好相反，推测大、小鼠肝脏对长期饮酒造成的肝损伤有较强的代偿能力，提高肝脏中GSH等抗氧化酶的储备量可能就是其代偿方式之一。虽然肝脏能部分代偿酒精带来的肝损伤，但摄入酒精给予肝脏的代谢压力仍然存在，肝脏代谢酒精会抑制肝脏中的三羧酸循环和脂肪酸代谢，因此肝脏对血液中甘油三酯和胆固醇等转运能力下降，以致血脂升高，肝细胞发生脂肪变性[9]。因此酒精造成的肝脏综合性影响仍然不能忽视，为更好评价和研究葛根护肝片对慢性酒精性肝损伤的保护作用，本研究选择了早期肝损伤生物标志物-GST、Arg-1、PNP和GLDH，这些指标在肝损伤阶段比ALT、AST等传统指标更早出现变化，且变化幅度大，作为肝损伤指标敏锐度要高于ALT和AST[10-12]，其中-GST存在于肝小叶中心细胞，属于肝脏代谢区，更具代表意义；其分子量小，在肝细胞膜早期损伤阶段就会透过细胞膜进入血液；-GST在红细胞中不表达，肌肉细胞中也几乎没有，因此不受溶血、运动疲劳等因素影响[13]，是非常理想的早期酒精性肝损伤指标。

葛根护肝片可以降低慢性酒精肝损伤大鼠血清中ALT、PNP、-GST、GLDH和Arg-1的活力，可降低血清中TC、TG和LDL-C的含量，减少肝脏中MDA的含量，减少肝脏脂肪变性程度，说明其不仅可直接降低慢性酒精性肝损伤程度，还可以缓解肝脏的脂代谢压力，从多方面改善大鼠慢性酒精性肝损伤，具体影响机制有待继续研究。