人参皂苷Rg3诱导结直肠癌细胞凋亡作用研究

孙丹丹，邹宜芳，宋柳，杨浩，初迪，韩淑兰，刘昕，郭建锋

（吉林大学药学院，吉林 长春130021）

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，已成为全球第四大致命癌症。据2018年全球癌症数据统计，新确诊CRC患者约180万人，且每年有近90万人死于该病，约占每年诊断出的癌症和癌症死亡数的10%[1,2]。目前，早期CRC治疗方法主要包括内窥镜或手术局部切除、局部消融治疗和姑息化疗等，晚期CRC治疗方法主要包括化疗和放射性治疗。但大剂量的化放疗产生不良反应和副作用，例如神经毒性和肝毒性[3-5]，严重降低了患者的生活质量，因此，建立更安全、有效的CRC治疗方法已成为医药学界亟待解决的重点问题。

人参系五加科多年生草本植物人参（Panaxginseng）的根茎，在我国有着几千年的药用历史。人参皂苷是人参中主要的活性物质，其中人参皂苷Rg3和人参皂苷Rh2具有抑制多种癌细胞生长的作用[6,7]。近年来，大量的文献[8-11]显示人参皂苷Rg3在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、逆转耐药、与化疗联合协同增效及提高机体免疫力等方面具有显著的作用。目前，已证实Rg3也可以抑制结肠癌细胞Caco-2的增殖和迁移，但其体外促进结直肠癌细胞凋亡机制还需进一步研究[12]。

为更好地研究Rg3的抗肿瘤效果，本文对其体外抗癌机制进行了研究。采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）对Rg3单体进行含量测定，并利用流式细胞术法和蛋白质印迹法（Western Blot,WB）测定Rg3诱导结直肠癌CT26细胞凋亡，为建立新型结直肠癌免疫治疗提供科学依据。

1 仪器与试药

数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；全自动雪花制冰机（常熟雪科电器有限公司）；高速冷冻离心机（Eppendrof有限公司）；低温离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司)；电子分析天平（美国丹佛仪器公司）；移液器（Thermo公司）；超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；倒置显微镜（Olympus公司）；CO2培养箱（SANYO公司）；化学发光凝胶成像仪（北京东胜创新科技有限公司）；电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；立式蒸汽压力灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；垂直电泳槽（上海天能科技有限公司）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；迷你转印仪（杭州诺扬生物技术有限公司）；多功能荧光酶标仪（美国Bio Tek公司）；微孔板恒温振荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；MYC-80上下摇跷跷板式振荡器（常州荣华仪器）。

RPMI 1640细胞培养基（美国Corning公司）；0.25%胰酶-EDTA（美国Corning公司）；FBS（以色列Biological Industries公司）；青-链霉素双抗（以色列Biological Industries公司；台盼蓝（北京索莱宝科技有限公司）；DMSO（天津百伦斯生物技术有限公司）；PMSF（上海碧云天生物技术有限公司）；RIPA细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；BCA工作液（北京全式金生物技术有限公司）；5 Protein Loading Buffer（上海碧云天生物技术有限公司）；牛血清白蛋白（上海碧云天生物技术有限公司）；SDS-PAGE预制胶（上海碧云天生物技术有限公司）；SDS（北京博奥拓达科技有限公司）；甘氨酸（美国VWR生命科技公司）；Tris（北京博奥拓达科技有限公司）；吐温-20（北京博奥拓达科技有限公司）；抗体Affinity（北京生物科技有限公司）；ECL发光液（上海翊圣生物科技有限公司）；Rg3（成都德斯生物技术有限公司）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件的确定与系统适用性试验

色谱柱为迪马C18色谱（4.6 mm 150 mm,5m）；流动相为50%乙腈和50%超纯水（含0.05%磷酸）；检测波长为203 nm；柱温为30℃；进样量为20L；流速为1.0 mL/min。理论塔板数按Rg3色谱峰计算，不得低于3 000。

2.2 MTT法

2.2.1 细胞培养小鼠结直肠癌CT26细胞属贴壁生长细胞，使用RPMI 1640完全培养基，内含1%的双抗和10%的FBS，在37℃、5%CO2和95%空气的无菌培养箱中进行常规培养。

2.2.2 细胞复苏在超净台中提前做好准备工作，取15 mL离心管，加入9 mL培养基备用，另取T25细胞培养瓶，加入5 mL完全培养基，准备完毕。将细胞从液氮中取出后，迅速在37℃恒温水浴锅中溶解，可适当轻轻摇动以加速溶解，完全溶解后，适当喷洒75%的酒精灭菌，快速移入超净台中，取出液体加入到事先准备好的离心管中，1 000 r/min离心5 min，离心后，弃上清液，加入适量完全培养基于离心管中，轻柔吹打重悬后，将重悬液吸出，全部加入到事先准备好的培养瓶中，轻柔摇晃使细胞在培养瓶中分布均匀，置于37℃培养箱中培养过夜，第2天观察细胞状态，若贴壁良好，弃掉旧培养基，无菌PBS清洗后，更换新培养基。

2.2.3 细胞传代在显微镜下观察细胞状态，若细胞长至70%~90%时对细胞进行传代。弃掉旧培养基，无菌PBS清洗后，加入适量含EDTA的胰酶进行消化，若细胞难消化可置于37℃培养箱中消化，显微镜下观察细胞状态，当细胞呈圆形、培养瓶底部呈现雾状时，加入适量完全培养基终止消化，用移液枪适当轻柔吹打培养瓶底部，尽量将全部细胞吹打下来，将培养瓶中的液体移到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，离心后，弃上清液，加入适量完全培养基于离心管中，轻柔吹打重悬后，吸取适量重悬液加入到含完全培养基的培养瓶中，轻柔摇晃使细胞在培养瓶中分布均匀，置于37℃培养箱中培养。

2.2.4 细胞冻存取对数生长期的细胞进行冻存。按照FBS:DMSO为9:1的比例配制细胞冻存液。弃掉旧培养基，PBS清洗后，加入适量含EDTA的胰酶进行消化，加入适量完全培养基终止消化，将培养瓶中的液体移到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，离心后，弃上清液，加入适量细胞冻存液重悬细胞，然后在冻存管中加入1 mL上述重悬液，封口膜封口。将冻存管放置在4℃冰箱30 min，﹣20℃冰箱2~4 h，﹣80℃冰箱中过夜，然后转移至液氮中长期保存。

2.2.5 IC50测定 取处于对数生长期的CT26细胞进行铺板，待细胞长至约70%时，胰酶消化，1 000 r/min离心5 min；PBS重悬细胞，使用台盼蓝进行计算细胞悬液浓度，按所得的结果将细胞悬液加入到96孔板中，5 000个/孔，在细胞培养箱中培养过夜，当96孔板内细胞密度为65%~75%时给药。将Rg3配制成一定浓度的母液，用完全培养基梯度稀释母液至设定的浓度。给药孵育24 h后，小心吸出孔内含药培养基，每孔更换100L基础培养基，然后每孔加入20L上述配制得到的MTT溶液，放置于细胞培养箱避光孵育4 h，孵育完成后，弃去孔内液体，每孔加入150L DMSO，放置于微孔板恒温振荡器中，37℃震荡孵育10 min，使孔内甲瓒充分溶解于DMSO中。使用酶标仪570 nm下检测各孔吸光度值，细胞存活率按照以下公式进行计算，并采用GraphPad Prism8.0软件计算IC50。

2.3 细胞凋亡测定

取2 mL对数生长期CT26细胞于6孔板中，每空细胞初始密度为2 105个，过夜，待细胞贴壁，长到60%左右进行给药。设置对照组以及给药6、12和24 h，给药浓度为2.2.5项中得到的IC50。弃掉孔中旧培养基，1 PBS轻柔洗一遍，使用不含EDTA的胰酶消化收集细胞（消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上PS与Annexin-V-FITC的结合；如果用含EDTA的胰酶消化，必须彻底清除EDTA：标记前用1 PBS或1 binding buffer洗涤，清除EDTA，以免残留的EDTA与Ca2+螯合影响Annexin-V的结合），室温2 000 r/min离心5 min收集细胞。1 PBS重悬，2 000 r/min离心5 min，弃上清液；加300L 1 binding buffer重悬细胞；加10L Annexin-V-FITC，涡旋混匀，避光常温孵育15 min；上流式细胞仪前5 min加10L PI；上流式细胞仪前补200L 1 binding buffer。

2.4 蛋白质印迹法

2.4.1 细胞铺板和给药消化细胞后使用台盼蓝计数，取10 cm2细胞培养皿，每皿加入2 106个细胞和10 mL培养基培养过夜，待细胞贴壁，长至60%左右进行给药。设置3个时间点6 h、12 h和24 h，给药浓度为2.2.5项中得到的IC50。

2.4.2 总蛋白提取 弃上清液，用无菌PBS清洗细胞3次；RIPA裂解液与PMSF按100:1混匀，使PMSF终浓度达到1 mmol/L，置于冰上待用；在培养皿中加入200L配制好的RIPA裂解液，用细胞刮刀使RIPA裂解液与细胞充分接触裂解；吸取裂解后的液体至1.5mL EP管中，14 000 g、4℃离心5 min，小心吸取上清液至新的EP管中，于﹣80℃冰箱保存。

2.4.3 BCA法测定蛋白浓度 按照BCA说明书，将试剂盒中的Solution A和Solution B以50:1的比例混合均匀，配制成BCA工作液；BSA Protein Standard母液为2 mg/mL，用蒸馏水稀释成不同浓度的液体，用于绘制标准曲线；向96孔板中加入20L上述不同浓度的BSA标准蛋白、待测样品和空白对照（n=3），每孔再分别加入200L BCA工作液，37℃恒温振荡，孵育30 min；待冷却至室温后，用多功能酶标仪检测562 nm处的吸光值。根据设置的标准蛋白浓度绘制标准曲线，并计算待测蛋白样品浓度；根据计算得到的样品浓度，将同组样品稀释成同一浓度，以方便后续试验。

2.4.4 电泳将蛋白样品和5 Loading buffer按照4:1的体积比混合均匀，95℃水浴煮沸10 min，使蛋白变性；将预制胶胶板安装到电泳槽中，加入1电泳缓冲溶液，拔出梳子，按照预先设计好的方式，在各孔中分别加入蛋白marker或蛋白样品。初始电压100 V，待样品到达分离胶后，将电压调整为130 V。

2.4.5 转膜将配制的1电转缓冲溶液在冰上预冷；裁剪一定规格和数量的滤纸备用；将PVDF膜提前5min浸泡在甲醇中激活；根据所检测蛋白的分子量，切取对应位置的凝胶；在转膜阴极板上依次铺海绵、3层滤纸、凝胶和PVDF膜，使用滚胶棒缓缓排除凝胶和PVDF膜之间的气泡，使二者紧密贴合；再依次盖上3层滤纸、海绵，夹紧夹板，放置在电转槽中，加满预冷的1电转缓冲溶液，恒流湿转，200 mA恒流，电压调至最大，转膜90 min，注意整个转膜过程在冰上进行。转膜后，将PVDF膜转移至5%BSA封闭液中，放置在翘板摇床上，轻微晃荡孵育3 h。

2.4.6 孵育抗体封闭后，将一抗按照推荐比例用封闭液稀释，分别加入到对应的PVDF膜上，4℃孵育过夜；吸出一抗稀释液，用TBST洗膜5次，每次5 min；将二抗按照推荐比例稀释后，加入到PVDF膜上，室温条件下，避光孵育1 h，TBST洗膜5次，每次5 min。

2.4.7 显影按照ECL显影试剂盒说明，将A液和B液按照1:1混合均匀，避光；将PVDF膜浸入ECL工作液中，孵育1 min；使用化学发光凝胶成像仪扫描成像，使用Image J软件计算各组蛋白条带灰度值，计算相对表达量。

2.5 统计分析

本实验采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据处理和相关统计学分析。

3 结果

3.1 液相条件确定

阴性样品、对照品溶液色谱图见图1 A。在与对照品峰相应的保留时间位置无干扰峰检出，即阴性无干扰。由图1 B可见，供试品溶液在色谱图相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液在此无峰，各主成分峰与其他组分分离良好，说明阴性样品对Rg3含量测定无干扰。

3.2 体外抑瘤效果

随着Rg3浓度增加对CT26细胞毒性增强，可知，Rg3对CT26细胞具有抑制作用。如图2，当Rg3浓度增加至12.5g/mL时，对CT26细胞开始出现毒性作用；随着浓度增至100g/mL时，CT26细胞存活率仅为（10.2±1.43）%，证明Rg3对CT26细胞有明显的抑制作用，且随给药浓度升高，细胞存活率逐渐下降。通过Graphpad Prism 8.0软件对实验结果进行处理，计算各细胞半数抑制最大浓度（median inhibition concentration,IC50），结果所得Rg3对CT26细胞的IC50值为（27.36±8.75）g/mL。

3.3 细胞凋亡

3.3.1 促进细胞凋亡 结果如图3和图4所示，细胞凋亡率与给药时间呈正相关。在给药6 h后开始出现凋亡现象，但与对照组相比差异不大；在给药12 h后凋亡细胞显著增加（P＜0.01），且在给药12 h到24 h之间凋亡细胞持续增多，尤其是CT26凋亡细胞数量由12 h的30%左右增加至24 h的80%。

图3 流式细胞仪检测分析Rg3处理CT26细胞后6 h、12 h、24 h细胞凋亡水平Fig.3 The apoptosis level of CT26 cell after treated with Rg3 determined for 6 h,12 h and 24 h by the flow cytometry

图4 流式细胞仪检测分析Rg3处理CT26细胞后6 h、12 h、24 h细胞凋亡水平量化图Fig.4 The apoptosis of CT26 cell treated with Rg3 determined for 6 h,12 h and 24 h by the flow cytometry

3.3.2 抑制细胞凋亡如图5，实验已证明Rg3能够活化多种Caspase蛋白从而诱导凋亡，因此通过抑制Caspase家族蛋白，可以间接证明Rg3对CRC细胞的抑制作用是通过凋亡引起的[13]。Z-VAD-FMK是Caspase家族蛋白抑制剂，能够不可逆地抑制Caspase蛋白活性。实验设计对照组和实验组，其中Z-VAD-FMK和Rg3联合给药组，需在给药前用Z-VAD-FMK预孵育4 h。如图5所示，与对照组相比，Z-VAD-FMK组未出现显著性差异（P＞0.05）；而在相同给药浓度的两组中，使用Z-VAD-FMK预孵育的细胞存活率有所增加（P＜0.05），说明封闭Caspase家族蛋白活性可减少细胞的凋亡死亡数量，侧面证明了Rg3可以通过凋亡的方式抑制肿瘤细胞生长，但是考虑到Z-VADFMK并未完全逆转细胞的死亡趋势，推测Rg3并非仅通过凋亡的方式引起细胞死亡。

图5 MTT法检测分析Z-VAD-FMK对Rg3处理CT26细胞毒性的影响Fig.5 The effect of Z-VAD-FMK on the toxicity of CT26(A)cells treated with Rg3 was analyzed by MTT assay

3.4 蛋白免疫印迹

如图6和表1所示，活化的c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK激酶）即P-JNK（46+54 kDa）表达较对照组显著增加（P＜0.001,P＜0.01）。JNK激酶可激活内质网基膜上的促凋亡因子BAX构象改变而活化，并弱化BCL-2的抗凋亡能力，这与实验结果相一致；BAX（21 kDa）在CT26结直肠癌细胞系中表达显著增加（P＜0.01,P＜0.01），而BCL-2（26 kDa）呈现完全相反的趋势（P＜0.001,P＜0.01），这也暗示着Rg3在激活内质网应激的同时，能进一步诱导结直肠癌细胞凋亡。

图6 WB法检测CT26细胞中细胞凋亡相关蛋白（BCL-2、BAX）表达情况Fig.6 The expression of apoptosis related proteins(BCL-2,BAX)in CT26 cells was detected by WB

表1 CT26细胞内凋亡通路蛋白（BCL-2,BAX）相对表达量Table 1 The relative expression of apoptosis pathway protein(BCL-2,BAX)in CT26 cells

4 讨论

CRC的治疗现状并不理想，传统的手术治疗仅适用于癌症早期，且会严重降低患者的生活质量，因此，建立更安全、有效的CRC治疗方法已成为医药学界亟待解决的重点问题[14]。

研究表明，人参皂苷Rg3在一定浓度范围内可以明显促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡，这可能与人参皂苷Rg3通过干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中的MGBA基因的表达，从而影响H2S/CSE系统的活性得以实现[15]。Rg3诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究表明，Rg3通过SP1升高和HSF1下调抑制了FUT4的表达，说明人参皂苷Rg3对胃癌患者具有有效的治疗作用[16]。由上可知，Rg3具有体外抑制肿瘤生长的作用，且机制各不相同。人参皂苷Rg3还可抑制人结肠癌细胞株SW480细胞的增殖，促进其凋亡，机制可能与抑制细胞间黏附分子1的表达，活化闭锁蛋白的表达有关[17]。但其对凋亡相关蛋白没做进一步研究，因此，我们进一步探讨了Rg3诱导结直肠癌凋亡作用，初步研究了其下游诱导凋亡相关蛋白的机制。

随着Rg3浓度增加，对CT26细胞出现明显的抑制作用，同时Rg3可促进CT26细胞凋亡相关蛋白的活化，诱导细胞凋亡，然而Caspase抑制剂可阻断Rg3诱导CT26细胞的凋亡，进一步证明Rg3通过诱导细胞凋亡杀伤CT26细胞。本文为人参皂苷研究和抗肿瘤药物开发提供依据，也为CRC的免疫治疗提供了思路和方法。