6 586例育龄妇女地中海贫血基因的携带率及基因类型*

龙丽, 万雪超, 杨晓琴

(1.铜仁市人民医院 检验科, 贵州 铜仁 554300； 2.铜仁市人民医院 产科, 贵州 铜仁 554300)

地中海贫血(thalassemia)一组由于珠蛋白基因突变导致某一种珠蛋白肽链缺乏或合成不足所引起的遗传性溶血性贫血病。由Lee和Cooley于1925年在地中海国家意大利人后裔中首次发现，故称地中海贫血，亦称海洋性贫血[1]。该病遍布全世界，但高发于地中海沿岸国家、中非洲、亚洲、南太平洋地区等。在我国长江以南也为地中海贫血的高发区，但以广西、广东、海南、贵州、四川、等省区多见。地中海贫血分为 α 型、β型、δ β 型和 δ 型4种，其中以 β 和 α 地中海贫血较为常见。贵州省铜仁市为少数民族聚居地区，目前还未有人对本市各族育龄妇女的地中海贫血分布情况进行研究分析，本研究拟采用基因诊断方法[2-6]对本地育龄妇女的 α -地中海贫血基因和β -地中海贫血基因进行检测分析，以了解本地育龄妇女地中海贫血基因携带率及基因类型的分布情况。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年8月—2020年12月进行地中海贫血基因检查的汉族、土家族、苗族、侗族育龄妇女6 586例为研究对象(研究对象的基本信息由产前诊断医师协助完成，均为贵州省铜仁市人)，年龄17～45岁，平均年龄(27±4.25)岁。所有受检者均抽取静脉血2～3 mL采血前均进行相关告知并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1血液标本采集 采集研究对象孕前或孕早期育龄妇女外周血2～3 mL，加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝的采血管，4 ℃冰箱保存血样。

1.2.2血液基因组DNA提取 DNA提取试剂盒使用广东凯普科技生物有限公司提供的离心柱提取试剂盒。具体提取操作步骤按照厂商提供的说明书进行。

1.2.3PCR扩增 核酸扩增试剂由广东凯普科技生物有限公司提供的，该试剂盒可检出3种常见α缺失、3种常见α突变及17种常见β突变。反应扩增程序为95 ℃ 15 min，97 ℃变性50 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4扩增产物杂交 PCR产物95 ℃变性10 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。铺好杂交膜条，预杂交45 ℃ 2 min，弃杂交液。42 ℃条件下杂交30 min，将杂交液重新放入水浴锅中。杂交30 min后，开泵进行导流杂交，将杂交膜上的溶液排净，关泵。从水浴锅中取出预热到42 ℃的洗脱液1溶液，吸取0.8 mL冲洗膜，加完后停留5 s，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；此步骤重复4次；加入封阻液封阻，加酶标液0.5 mL，溶液A清洗4次，加显色液0.5 mL显色6 min；加杂交液0.8 mL，清洗3次；加蒸馏水清洗晾干。

1.2.5结果判读 杂交试剂盒共检测17种 β -地中海贫血基因 ：41-42M、71-72M、17M、43M、IntM、14-15M、Ivs1-1M、27-28M、31M、654M、-28M、-29M、βeM、Ivs1-5M、CapM、-30M、-32M。6种 α -地中海贫血基因：SEA 、α 3.7、α 4.2、CSM、QSM、WSM。对该试剂盒未检出的怀疑罕见地中海贫血基因的样本送至广州凯普生物有限公司作进一步测序检查。

1.3 观察指标

计算育龄妇女人群的 α -地中海贫血基因携带率与 β -地中海贫血基因携带率，比较该人群汉族、土家族、苗族、侗族育龄妇女地中海贫血基因类型分布。

1.4 统计学方法

使用SPSS 26.0统计软件，对检测结果的不同分组进行差异性分析。计数资料比较用率(%)表示，用χ2检验进行统计分析。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 地中海贫血基因基因突变及缺失位点分布

本次研究检出地中海贫血基因携带者680例，携带率为10.32%；其中 α -地中海贫血基因携带者336例(携带率为5.10%)、β -地中海贫血基因携带者323例(携带率为4.90%)、混合地中海贫血携带者21例(携带率为0.32%)。

2.1.1α -地中海贫血 检出的336例 α -地中海贫血基因携带者中东南亚型缺失(--SEA/α α)杂合子133例(占比39.58%)、右侧缺失型(-α3.7/α α)杂合子134例(占比39.88%)，是本地区的α地中海贫血主要类型(表1和图1)。

表1 α-地中海贫血各基因突变类型及分布

正常个体 --SEA/αα杂合子 -α3.7/αα杂合子 -α4.2/αα杂合子

2.1.2β -地中海贫血 检出的323例β-地中海贫血基因携带者中17M杂合子122例(占比37.77%)、41-42M杂合子135例(占比41.79%%)，是本地区的主要β地中海贫血类型(表2和图2)。

41-42M杂合子 17M杂合子 43M杂合子 654M杂合子

表2 β-地中海贫血各基因突变类型及比例

2.1.3罕见地中海贫血 检测结果与临床诊断不符的样本进行基因测序分析，本研究中共检出罕见地中海贫血2例，测序结果见图3。

注：A为341T>A突变，箭头所示为β基因编码区序列的341号碱基T突变为A，B为170G>A突变，箭头所示为β基因编码区序列的170号碱基G突变为A。

2.2 α-β 复合地中海贫血

本次研究共检测到 α-β 复合地中海贫血 21例，复合型地中海贫血基因型分布以-α3.7/αα与41-42M复合型和--SEA/αα与41-42M复合型占比最高，达33.33%和23.81%，见表3和图4。

654M复合α3.7缺失杂合子 41-42M复合α3.7缺失杂合子

表3 α-β 复合型地中海贫血类型

2.3 各民族育龄妇女地中海贫血基因类型分布

本次研究中对6 586例育龄妇女进行地中海贫血基因检测，汉族育龄妇女共检出地中海贫血314例，其中土家族152例、苗族141例及侗族73例，各民族间携带率比较差异无统计学意义(χ2=11.454，P=0.075)。见表4。

表4 各族育龄妇女地中海贫血基因携带情况

3 讨论

地中海贫血是一种单基因遗传病，是由于合成珠蛋白的基因缺陷致使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或者不能合成、导致血红蛋白的组分发生改变的常染色体隐性遗传病[7]。在临床上可以根据其不同类型划分为α-地中海贫血、 β-地中海贫血和异常血红蛋白病等[8]。正常人有4个α基因，分別位于第16对染色体上，若其中3个α基因缺失，出生时血红素会偏低。若是4个α基因都缺失，在胎儿时期就会因α2γ2不足，而引起重度贫血，导致流产、死胎，或出生不久即死亡[9-10]。如果父母亲都是2个α基因缺失的携带者，生下重度贫血患儿的机率为1/4。正常人有2个β基因，分別位于第11对染色体上，若是单基因突变，为轻度地中海贫血，而双基因突变者，常表现为中或重度β型地中海贫血，出生时症状不明显，到4～6个月大的时候，才会逐渐表现贫血的症状，并且终生都需要进行输血治疗或进行骨髓移植治疗[11]。重症地中海贫血患儿的出生给患儿家庭带来极大的痛苦和经济负担，严重影响当地的人口质量，因此预防地中海贫血、减少出生缺陷是提高人口质量的战略需求。

本次研究中直接采用外周静脉血进行地中海贫血基因诊断，未经过常规地中海贫血筛查(血常规检测、血红蛋白电泳)，极大地减少了地中海贫血基因携带者的漏检，能够检出更多的地中海贫血基因携带者，更实际地反映本地人群中地中海贫血基因携带的情况。本研究共对6 586例育龄妇女进行地中海贫血基因检测，检出地中海贫血基因携带者680例，携带率为10.32%。在本次筛查中α-地中海贫血基因携带者336例，α -地中海贫血基因携带率为5.10%。筛查共检出11种α-地中海贫血基因型，其中α -地中海贫血缺失型主要为东南亚型缺失(--SEA/α α)杂合子和右侧缺失型(-α3.7/α α)杂合子，占α -地中海贫血的39.88%和39.58%，是本地α -地中海贫血的主要类型，与国内其他省份的研究较一致；α -地中海贫血突变类型主要为CSM杂合子，占α -地中海贫血的7.44%与涂志华等[12]所作海南省陵水黎族育龄妇女检测结果不同。本研究共检出 β -地中海贫血基因携带者323例，携带率为4.90%，有14种基因型，其中检出17M杂合子122例、41-42M杂合子135例，占β地中海贫血的37.77%和41.79%%，是本地 β -地中海贫血基因突变主要类型；混合型地中海贫血携带者21例，有7种基因型，携带率为0.32%。本次研究结果与刘兴梅等[13]、黄盛芳等[14]所做贵州省人群的地中海贫血基因检测结果较一致，α -地中海贫血的主要类型都为东南亚地贫缺失型； β -地中海贫血的主要类型为41-42M和17M；但低于广西、海南等地[15-16]，而所作重庆、云南地区人群较一致[17-18]。这一差异可能与地域有关，广西、福建、海南等地靠近赤道为疟疾高发地区，红细胞的变异能够逃避疟原虫的攻击，使其免于疟疾感染[19]，因此疾病在这一地区表现高发。本研究的6 586例受检者主要由4个民族构成，其中汉族2870例、有314例携带有地中海贫血基因(携带率为10.94%)，土家族1529例，有152例携带有地中海贫血基因(携带率9.94%)，1352例苗族共检出地中海贫血基因携带者141例(携带率10.42%)，835例侗族检出地中海贫血基因携带者73例(携带率8.74%)。各民族间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与本地各族群之间相互融合，通婚，使基因分布频率发生了改变所致。此次研究结果显示各民族之间的地中海贫血基因携带率高于杨先燕等[20]所作的研究。通过本次研究，了解铜仁市各民族地中海贫血基因的携带情况，能够根据各民族地中海贫血基因的遗传特点制定相应的防控措施。

综上所述，本研究提示在本地育龄妇女中地中海贫血基因携带率较高，以α -地中海贫血和β -地中海贫血为主，纯合仔和复合型地中海贫血较少。