多黏菌素B对大鼠全脑缺血再灌注时脂多糖所致损伤的保护作用及机制*

郑思敏， 李思远， 牛晓丽， 杨毅猛， 薛荣亮

(西安交通大学第二附属医院 麻醉科， 陕西 西安 710041)

研究表明，脑缺血再灌注损伤的机制由多因素共同参与并相互作用。低血压、休克、心脏骤停可致全身多器官缺血，其中肠道是敏感器官。肠道缺血引起肠黏膜屏障受损，大量释放细菌内毒素入血，启动多损伤环节，对肠外器官造成损伤[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)存在于革兰阴性菌的细胞膜上，是一种内毒素，在对动物发病机理的研究中，LPS作为主要的炎症因子，可引起机体发热、血压下降、激活炎症反应等[2]。研究发现，LPS多聚体与宿主的LPS结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)结合后，激活外周血单核细胞表面的LPS受体，即白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)，通过LPS/ Toll样受体4 (toll like receptor 4,TLR4)信号通路激活相关的基因转录，诱导肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等早期促炎因子的生成，如血小板激活因子、白三烯等促炎因子，进而加重各器官的损伤[3]。多黏菌素是从多黏杆菌中分离的一类抗生素，用于临床的有多黏菌素B(polymycin B，PMB)和多黏菌素E(polymycin E，PME)，PMB通过其具有疏水性的阳离子结构与类脂A特异性结合，抑制LPS的生物活性[4]。关于PMB在脑缺血再灌注损伤的中的作用机制目前尚未完全清楚，因此，本研究通过建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型，并尾静脉注射用PMB及LPS，分析大鼠的神经行为学评分、海马组织的细胞凋亡率、LPS含量及TLR4表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组 健康清洁的成年雄性SD大鼠144只，体质量200～250 g，由西安交通大学医学院动物中实验心提供，按照随机数字表法分为对照组(SH组)、模型组(IR组)、脂多糖组(LPS组)和多黏菌素B组(PMB+LPS组)，每组36只。后3组大鼠采用经典四血管法建立大鼠全脑缺血再灌注模型[5]，LPS组再灌注后即刻尾静脉注射LPS(500 μg/kg)[6]，PMB+LPS组再灌注后即刻尾静脉注射LPS、注射完毕后立即更换注射器尾静脉注射PMB(0.5 mg/kg)[7]，SH组及IR组再灌注后即刻注射等量生理盐水。每组根据再灌注时间的不同再分为2、6、12、24、48及72 h 六个亚组，每亚组6只。各组大鼠按要求在预定时间点麻醉后处死。

1.1.2试剂和仪器 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析试剂盒购自美国R&D Systems公司，LPS购自美国sigma公司PMB购自美国INALCO公司，Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；液氮罐由中国成都生产，超净工作台购自美国Airtech公司，低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，包埋机购自德国leica公司，烤片机购自德国leica公司，石蜡切片机购自德国leica公司，倒置显微镜购自德国leica公司，计算机图像分析系统购自德国leica公司。

1.2 实验方法

1.2.1模型制备 采用四血管法建立大鼠全脑缺血再灌注模型[5]。10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射对大鼠进行麻醉，大鼠翻正反射及痛觉消失视为麻醉满意；麻醉满意后采用俯卧位固定四肢，头前倾约30°，同时用橡皮筋栓住大鼠尾巴以轻微力量牵拉，使颈椎伸直，此时翼小孔呈水平位便于观察；取枕骨下第一颈椎水平做正中切口，逐层分离肌肉，仔细分离双侧第一颈椎横突，暴露翼小孔，双侧翼小孔下各有椎动脉通过，用烧红的探针刺入翼小孔烧灼椎动脉，使之永久闭塞，避免损伤脊髓及枕后三角区神经，逐层缝合皮下及皮肤。术后单笼饲养，保持室温20～25 ℃，并用60 W白炽灯持续照射24 h，防止体温下降；同时保持大鼠呼吸道通畅，密切观察其复苏过程。术后第2天，同法麻醉后仰卧位固定，取颈正中切口，仔细分离双侧颈总动脉(注意勿伤及与之伴行的迷走神经)、分别微动脉夹夹闭6 min、松开微动脉夹恢复脑血流、逐层严密缝合。术后单笼饲养，条件如前。SH组仅进行组织解剖及缝合，不给予凝断椎动脉及夹闭双侧颈总动脉处理。

1.2.2神经行为学评分[9]大鼠处死前30 min由一名不清楚实验分组的研究人员对所有大鼠进行神经行为学评分，分为步态协调、平衡木实验及斜扳试验。(1)步态协调：缺失(表现为静止或原地转圈)记1分，不正常(表现为步态摇晃且速度减慢)记2分，正常记3分。(2)平衡木实验：大鼠放置于长1 m、宽2 cm、离地面0.5 m的圆形平衡木上，记录大鼠的表现；立即脱落记1分，试图停留记2分，可正常停留记3分。(3)斜扳试验：将大鼠头向下倒置在45°斜面上，观察大鼠是否能转为头向上>135°及爬行情况，迅速转为头向上>135°、且可顺利向上爬记1分，抓握斜面>5 s后转为头向上>135°、爬行困难记2分，顺斜面下滑记3分。

1.2.3LPS含量 各组大鼠按要求在预定时间点麻醉后处死、断头，撬开颅骨，完整取出大脑组织置于盛有4 ℃ PBS溶液的培养皿中，剥离脑膜和脑皮质分离出双侧海马组织，立即置入液氮罐冻存，后转移至-80 ℃冰箱保存，1个月内进行ELISA检测LPS含量。

1.2.4细胞凋亡率检测[8]按照1.2.3的方法分离出大鼠双侧海马组织，再用PBS溶液洗去海马组织上残留血液后放入装有4 ℃ PBS溶液的离心管中，置入冰盒保存，在30 min内进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5海马CA1区TLR4阳性表达 将不同时间点处死的各组大鼠沿枕骨撬开颅骨，仔细剥离蛛网膜及软膜，取出完整大脑，在视交叉后1 mm及视交叉后4 mm处各切一刀(即海马头端)取冠状面组织块；于4%多聚甲醛液中浸泡，4 ℃保存3 d，常规石蜡包埋，并采用切片机连续脑冠状面切片制备蜡块。按照试剂盒说明书进行HE染色，在光镜下观察各组大鼠各时点缺血再灌注的右侧海马组织病理学变化，胞质呈现棕黄色即表示阳性细胞，随机选择海马CA1区5个视野(× 400)进行阳性细胞计数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 神经行为学评分

结果显示，随着时间的延长，与LPS组相比，IR组和LPS+PMB组大鼠的神经行为学评分增加(P<0.05)，但上述3组各时点评分均低于SH组(P<0.05)。见表1。

表1 再灌注后不同时点4组大鼠神经行为学评分

2.2 海马组织LPS含量

结果显示，4组大鼠各时点LPS含量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中SH组各时点海马区LPS含量最低，LPS组最高(P<0.05)。随着时间的延长，IR组和LPS组大鼠海马组织LPS含量均于再灌注2 h时开始增多，24 h达高峰，随后缓慢下降，且各时间点均明显高于SH组(P<0.01)；LPS+PMB组大鼠海马组织各时间点LPS含量较LPS组均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 再灌注后不同时点4组大鼠海马组织LPS含量

2.3 海马细胞凋亡率

结果显示，SH组海马细胞各时点细胞凋亡率变化不明显(P>0.05)，其他3组于再灌注后2 h海马细胞的凋亡率开始升高、24 h达峰值、72 h开始下降；各时点海马细胞凋亡率比较LPS组>IR组>LPS+PMB组>SH组(P<0.05)。见表3。

表3 再灌注后不同时点4组大鼠海马细胞凋亡率

2.4 海马CA1区椎体细胞损伤

HE染色结果显示，与SH组比较，IR组各亚组大鼠海马CA1区椎体细胞受损严重；LPS组2 h亚组大鼠海马可见少量异常椎体细胞，胞浆强嗜酸性变、核固缩、无核仁消失，随再灌注时间延长，椎体细胞排列紊乱、异常细胞数目增多、体积缩小，胞浆、胞核固缩明显，可见核仁消失，核碎裂，溶解；以24 h亚组受损最为严重。LPS+PMB组大鼠海马组织学改变介于LPS组与IR组之间。再灌注24 h各组海马CA1区细胞形态见图1。

注：箭头所指为阳性细胞。

2.5 海马CA1区TLR4阳性细胞指数

结果显示，SH组及IR组大鼠海马CA1区各时点TLR4表达较少，LPS组大鼠海马CA1区大鼠海马CA1区TLR4的表达于再灌注2 h时即出现升高、24 h达高峰、72 h表达下降(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+PMB组及IR组大鼠海马CA1区各时点的TLR4表达均下降(P<0.05)。见表4、图2。

注：箭头所指为阳性细胞。

表4 再灌注后不同时点4组大鼠海马CA1区TLR4阳性细胞指数

3 讨论

当机体处于低血压、休克、心脏骤停及脑卒中等状态中时可出现脑缺血再灌注[10]，因为脑组织的能量几乎完全依靠葡萄糖的有氧氧化提供，其能量储备十分有限，故对缺氧耐受性极差[11]。因此，缺血再灌注会引起一系列的病理生理改变，使大脑出现严重的机能障碍。有研究发现，常温状态下，完全缺血10 s，脑组织储备氧即可耗尽，葡萄糖有氧代谢终止，2～4 min脑组织储存的葡萄糖及糖原耗竭，完全缺血4 min后，脑组织内能量几乎为零，最终导致大脑功能和形态结构的改变[12]。因此，对于脑缺血再灌注的病理生理及保护机制的研究至关重要。

细胞凋亡(apoptosis)是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程，具有主动性、选择性、可逆性的特点。它的发生受到机体的严密调控。凋亡并不完全等同于程序性的细胞死亡(programmed cell death，PCD)，凋亡是脑缺血再灌注损伤的主要病理生理机制之一[13]。肠道是失血性休克缺血再灌注损伤受累最早的器官之一，是应激反应的中心，且肠道对休克的反应最敏感。在休克有效循环血量减少时，机体为维持心、脑等重要脏器的血液供应，全身血液重新分配，胃肠道血流明显减少。低血容量尚未产生全身症状或生命体征变化时小肠和结肠的血流已减少50%，故肠道缺血发生在早期[14-16]。即使经过复苏，在血流动力学恢复正常后，肠道血流量仍低于正常水平。肠内细菌经肠黏膜至局部淋巴结或血液的这一现象称为细菌移位，细菌移位可引发菌血症或脓毒血症，感染组织器官。肠道细菌和内毒素吸收入血，作用于靶器官，释放大量炎性介质、氧自由基，前列腺素及多种细胞因子，损伤内皮细胞，产生细胞毒效应和全身代谢紊乱，最终导致远端器官的损害[17-19]。已经有研究报道LPS对肺脏、肝脏、肾脏等组织缺血再灌注时的损伤作用[20]，但对脑组织的研究未见报道。

本研究结果表明，除对照组外，其他各组再灌注后2 h海马神经元开始发生凋亡，且凋亡率随时间延长不断升高，于24 h达峰值，72 h开始下降。且LPS组各时点的凋亡率均高于其他3组，提示LPS可增加全脑缺血再灌注导致的海马神经元凋亡。但对LPS组小鼠尾静脉注射PMB后，各时间点大鼠海马区LPS含量均较LPS组减少，神经元凋亡率下降，提示PMB可能对损伤起到一定的抑制作用[21-22]。

进一步对各组大鼠进行神经行为学评分，结果提示PMB+LPS组的评分高于LPS组，再次提示在大鼠全脑缺血再灌注时，PMB对内毒素所致的神经元损伤有保护作用。SH组各时点血清TLR4表达很少，而其他3组于再灌注2 h即出现升高，24 h达高峰，之后开始减少，但仍处于较高水平，且均高于SH组。研究还发现LPS组各时点均较IR组表达增加，而LPS+PMB组各时点均较IR组表达减少，提示PMB对大鼠全脑缺血再灌注时造成的损伤可以起到一定的保护作用，且这种保护作用可能是通过抑制了TLR4的表达而实现的[23-25]。

综上所述，全脑缺血再灌注时脑组织内LPS含量随时间不断变化并造成大脑损伤，PMB对该种损伤有保护作用，可能是通过抑制TLR4的表达进而阻止损伤。