镜检和疟原虫抗原快速检测（RDT）胶体金法及巢式PCR法在疟疾诊断中的价值

梁文娇

（辽宁省朝阳市疾病预防控制中心微生物检测所，辽宁朝阳 122000）

疟疾是临床上常见的一种危害性寄生虫疾病，主要由感染疟原虫引起，另外也是通过蚊媒传播的一种热带病，目前广泛流行于热带与亚热带地区，而本地未出现感染病例[1]。因近年来出国务工人员不断增加，疟疾疑似病例也在随之上升，故临床对该病诊断的要求更高[2]。目前对于该病的临床诊断方法较多，如镜检、疟原虫抗原快速检测（RDT）胶体金法及巢式PCR法等，各诊断方式的检出率也存在一定的差异。基于此，本研究选取2019年2月至2020年2月本中心接收的疑似50例疟疾患者作为研究对象，探究镜检、RDT胶体金法、巢式PCR法在疟疾诊断中的价值，旨在为指导临床合理抗疟疾提供重要支持与参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2019年2月至2020年2月本中心收治的疑似疟疾患者50例作为研究对象，其中男27例，女23例；年龄18～70岁，平均年龄（54.48±3.27）岁。本研究经本院医学伦理委员会批准通过。纳入标准：伴有疟疾症状患者；自愿签署知情同意书。排除标准：合并肝、肾功能障碍、恶性肿瘤、造血系统疾病及其他相关疾病者；并发严重脏器功能衰退者；精神异常者；拒绝参与研究者。

1.2 试剂与仪器试剂：疟原虫抗原快速检测（RDT）胶体金试剂盒（广州万孚生物技术股份有限公司）、DNA提取试剂盒（磁珠法，江苏硕世生物科技有限公司）、DL2000Marker（宝生物工程）、琼脂糖，引物由辽宁省疾控所提供。仪器：伯乐IQ5PCR扩增仪、凝胶成像系统为BIo-BEST（西蒙国际集团）。

1.3 方法

1.3.1 镜检法根据WS 295-2015《疟疾诊断标准》[3]附录C《病原学检查》与WS/T 569-2017《疟原虫检测血涂片镜检法》[4]相关要求制作薄、厚血膜各1张，并染色镜检，对血涂片进行密切观察，虫体密度=疟原虫术/白细胞数×每微升血中白细胞数-疟原虫密度。

1.3.2 RDT胶体金法抽取患者5μL抗凝血，以垂直方式加入反应卡加样区，在加裂解液区滴加裂解液4滴，于15 min内读取结果。

1.3.3 巢式PCR法①第1轮：PCR，Mix 12.5μL，模板1μL，上下游引各1μL，ddH2O 9.5μL；反应程序：94℃3 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃60 s，2～4循环34次后，72℃时，时间为5 min。②第2轮：PCR与反应程序与上述一致。经1.5%琼脂糖凝胶电泳后扩张产物，在凝胶成像系统中观察最终结果。

1.4 观察指标 以实验室检测结合临床特征结果作为金标准，比较镜检、RDT胶体金法、巢式PCR法在诊断疟疾中的准确度[准确度=（真阳性+真阴性）/总例数]、灵敏度[（灵敏度=真阳/（真阳性+假阳性）]、特异度[特异度=真阴性/（假阴性+真阴性）]、阳性预测值[阳性预测值=真阳性/（真阳性+假阳性）]、阴性预测值[阴性预测值=真阴性/（假阴性+真阴性）]。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料组间率（%）比较采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 诊断结果经实验室检测结合临床特征结果显示，50例疑似疟疾患者中，阳性36例，阴性14例。

2.2 3种检查方式诊断效能比较经镜检法检出疟疾28例，检出率为46.67%；经RDT胶体金法检出疟疾35例，检出率为58.33%；经巢式PCR法检出疟疾30例，检出率为50.00%；RDT胶体金法准确度及灵敏度均高于镜检法、巢式PCR法，差异有统计学意义（P＜0.05）；3种诊断方法特异度、阳性预测值、阴性预测值比较差异无统计学意义，见表1～4。

表1 镜检结果与检查结果比较Table 1 Comparison of microscopic examination results and inspection results

表2 RDT胶体金法诊断结果与检查结果比较Table 2 Comparison of diagnostic results and inspection results of RDT colloidal gold method

表3 巢式PCR法诊断结果与检查结果比较Table 3 Comparison of diagnostic results and inspection results of nested PCR

表4 3种检查方式诊断效能比较（%）Table 4 Comparison of diagnostic efficiency of 3 inspection methods(%)

3 讨论

我国曾将疟疾的发生率控制在较低水平，但近期该病疫情呈不断回升状态，表明防治工作仍较严峻。由于该疾病患者在以往使用抗疟药物相对较多，对原虫的正常形态造成了严重性破坏，导致外周血疟原虫抑制作用较强[5-6]。因此，选取适宜的检查方法，及时、准确诊断至关重要，是控制疫情回升、有效预防及治疗疟疾的关键。

镜检是显微镜检查的简称，是指将待检标本取样、制片、观察（显微镜下）、分析、判断。RDT胶体金法又称金标法，具有简便快捷、适用性广等特点，该诊断方法能准确的诊断出大部分阳性者，目前已被广泛应用于临床检验[7]。巢式PCR法属于一种聚合酶链式反应，可充分利用2对PCR引物对完整的片段进行扩增，第1对PCR引物扩增片段接近于普通的PCR，而第2对引物可将其称之为巢式引物结合在第1次PCR产物的内部，使第2次PCR扩增片段明显短于第1次[8]。有研究[9]报道，快速检测条法对卵形疟的准确性并不理想，但应用于本研究样本检测中，显示为阳性，该结论可能与患者体内pLDH含量及带虫率相关。胶体金法难以区分恶性疟以外的其他疟疾，故常依赖镜检与巢式PCR法加以区别。本研究结果表明，RDT胶体金法准确度及灵敏度均高于镜检法、巢式PCR法，差异有统计学意义（P＜0.05）；3种诊断方法特异度、阳性预测值、阴性预测值比较差异无统计学意义。分析原因为，给予患者治疗疟原虫前，在红细胞中呈现的形态不仅完整，且密度高，通过镜检较易检出，而疟原虫在药物治疗中出现破坏（本身形态）、分解及裂解等不良情况下，增加了染色镜检的检出难度系数，故检出率低。对于低流行区，在分子生物学诊断技术中，胶体金法的特异性强、灵敏度高等优势可能与本研究样本量较少有关，其次胶体金试剂仍在不断的改进中，与其自身敏感性提高有关。随着境外输入病例的不断上升，复杂的临床表现及用药等均影响阴性检出率，故在疟疾流行区的基层工作中，将3种诊断方法相互结合与补充，有助于提高诊断率[10]。

综上所述，在疟疾临床诊断中，胶体金法具有较高的灵敏度及检出率，可与镜检、巢式PCR法联合诊断，以进一步提高检出率，为临床提供重要依据。