白酒酿造微生物分析方法研究进展

蔡凤娇，蒋燕明，饶建军，夏燕，李大海，张瑞景，徐健*

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，工业微生物湖北省重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068；2.湖北琪谱检测技术有限公司，湖北 武汉 430068；3.丹阳颐和食品有限公司，江苏 镇江 212300）

白酒是一种具有几千年文化历史的中国传统蒸馏酒，也是世界上消费量最大的蒸馏酒之一[1]。白酒生产过程中，微生物的种类、数量、分布及其消长变化等是影响酒的风味品质以及其典型香型的重要因素[2]。了解白酒风味产生的机理及白酒酿造过程中微生物的功能，并将其分离纯化从而进一步研究利用是提升白酒质量口感的一个重要途径。

传统的平板分离方法让成千上万的酿造微生物得以分离从而可以进行后续研究，但截至目前，能用平板进行分离培养的微生物仅占0.1%～1.0%[3]。随着基于以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），如变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、定量实时 PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）、单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、高通量测序等分子生物学技术的应用，复杂体系的微生物群落结构及功能研究蓬勃发展[4-7]。现代生物测序可以分析更多的微生物，挖掘它们的功能基因，同时，这些代谢途径独特，具有特殊功能的微生物需要传统平板培养分离来验证其生理代谢特性，才能进一步加以应用[8]。因此，关于白酒酿造微生物的研究，现代生物测序法与传统培养分离法需要互为补充、相辅相成。而且，随着气相色谱、高效液相色谱、气质联用等分析方法以及统计学方法的应用，微生物的代谢功能及代谢产物研究更加方便。

对平板分离、以PCR为基础的微生物指纹图谱、高通量测序等技术在白酒酿造微生物中的应用，以及微生物与风味化合物的关联性分析进行介绍，并比较不同方法之间的差异性，可以为白酒酿造微生物的研究提供参考。

1 平板分离鉴定方法

传统的平板分离鉴定方法是在白酒生产过程中，通过不同的筛选培养基将其多次分离纯化培养后进行菌种鉴定。平板分离鉴定方法虽然耗时比较长且分离的微生物种类有限，但在功能性菌株的筛选及研究中是必要且有效的。越来越多的研究者从白酒生产的原料、酒曲及环境中筛选分离出功能性菌株。因此，传统平板分离鉴定方法依旧是白酒酿造微生物研究的一个重要手段。

白酒酿造过程中，糖化酶、淀粉酶、蛋白酶对原料的分解利用为白酒微生物提供可利用的糖和氨基酸，供微生物繁殖代谢产生风味物质。梁香等[9]用平板划线分离法从黄酒酒曲中分离出12株糖化菌株，并用孟加拉红培养基筛选分离出一株具有优良糖化功能的曲霉菌株。钟小娟等[10]用淀粉酶培养基从酒鬼酒制曲车间内筛选分离出4株产高活力淀粉酶的芽孢杆菌。酯类化合物在白酒风味物质中占比较大，是影响白酒风味口感的重要因素。Zhao等[11]从浓香型白酒发酵酒醅中筛选出一株能产生214.7 mg/100 mL己酸乙酯的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereu），该菌株的应用可以提高白酒中己酸乙酯含量从而改善浓香型白酒风味。Fan等[12]从古井贡大曲中筛选分离出一株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604，在最优的发酵条件下，该菌株的乙酸乙酯产量达到16.92 g/L。功能性白酒酿造微生物也经常被筛选应用于其它发酵食品。腾军伟等[13-14]用平板划线分离法从江米酒酒曲中分离出11株细菌和2株真菌，并用酪蛋白平板筛选分离出1株高产凝乳酶的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），将该菌株应用于马苏里拉干酪的生产，提高了干酪中可溶性蛋白及游离氨基酸的含量。

传统平板分离法虽在白酒酿造微生物的分离鉴定中有着重要作用，但其只能分离易于培养的微生物，且耗时长，因而无法全面、高效地了解白酒酿造中微生物区系结构。应用分子生物学技术可以从多层面分析酿造微生物的群落结构及功能，有效地解决了这一问题。

2 以PCR为基础的微生物DNA指纹图谱鉴定技术

由于传统平板分离鉴定方法的局限性，以PCR为基础的微生物DNA指纹图谱方法迅速发展，如表1所示，微生物指纹图谱的应用相比于传统平板分离方法能更加快速准确地鉴定微生物甚至是不可培养的微生物个体，同时对白酒酿造微生物的群落结构演替规律、动态变化进行分析。

表1 白酒酿造微生物群落研究方法及比较Table 1 Research methods and comparison of microbial communities in Baijiu brewing

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RT-qPCR是PCR技术的升级，RT-qPCR技术通过荧光信号分析扩增产物，通过标准曲线定量分析样品模板，可推断出目的基因的初始量[29]。白酒酿造过程中各微生物的数量是不断变化的，而传统平板分离法对于不可培养的微生物无法监测其变化，利用RT-qPCR技术可以及时有效地了解到更多白酒酿造微生物的种类及数量变化。

PCR-DGGE不需要经过耗时的传统培养分离，通过样品中微生物的DNA或RNA信息就可以直接对微生物进行鉴定分析，是分析微生物群落结构的有效方法[30]。Zhang等[31]首先将PCR-DGGE技术应用到白酒研究中，结果表明浓香型白酒的真菌群落具有较高的多样性，真菌多样性的变化表明真菌的种类随着发酵时间延长而不断降低，并且还构建了包含120个18S rRNA克隆序列的基因克隆文库。王海燕[6]运用PCRDGGE技术研究了清香型汾酒大曲和酒醅中微生物群落结构演变规律，在大曲中检测到16个种属的微生物，发现了更多传统平板分离方法未能检测到的菌种。向凡舒等[16]应用PCR-DGGE技术对古襄阳白酒窖泥微生物进行多样性分析，明确了新窖与老窖中的微生物多样性具有明显差别，且新窖中主要以耐酸乳杆菌为主。PCR-DGGE技术仅能检测含量在1%以上的主要微生物，且其结果分析依赖于基因数据库，因基因数据库的序列信息不够全面，因此该方法也有一定局限性。

PCR-SSCP可以检测任何（包括已知和未知的）DNA位点上的多态性和突变，灵敏度高，适合于DNA变异的检测，也可以用来分析白酒酿造微生物的多样性。罗惠波[4]用PCR-SSCP对浓香型大曲微生物群落进行分析，结果表明，发酵各时期曲样的群落结构相似，同时也具有多态性。

末端限制性片段长度多态性（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）也是以 PCR 为基础的DNA指纹图谱技术，它可以快速准确地估算微生物的丰富度和群落组成[32]。T-RFLP的原理是在PCR中使用了一组荧光标记的引物，从细菌群落DNA扩增部分16S rDNA序列。然后，将所得的混合扩增子进行限制酶切，以产生荧光标记的末端限制片段的混合物，其具有与特定微生物相对应的特定大小。每个末端限制片段的确切大小再经过毛细管电泳来确定。

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术是从基因组DNA限制性酶切片段进行选择性PCR扩增。它涉及两个扩增步骤：低水平或预选择性扩增，然后是更具选择性的扩增，这会生成一组片段，可用作特定样品的特异性标记。Lazzi等[20]应用AFLP技术对78株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）进行了遗传性表征，更好地了解了嗜热链球菌的微生物多样性。

3 高通量测序技术

高通量测序技术相对于微生物DNA指纹图谱方法来说检测的通量更大，检测限更低，也因它具有灵敏度高、准确性强、可处理数据大等特点而得到广泛应用[33]。它通过对微生物群体进行高通量测序，可以短时间内测定几百万条到10亿条DNA序列，并且，检测限相比于PCR为基础的指纹图谱更低。目前常用的高通量测序方法包括扩增子测序、宏基因组测序、宏转录组测序等。

扩增子测序技术在白酒微生物群落结构研究中最为常见，它是基于微生物基因组的特征性序列进行测序和分类，研究目的倾向于物种的分类识别和相对丰度统计。Wang等[34]对不同轮次酱香型白酒发酵过程总的微生物群落进行扩增子测序，结果共鉴定出27个细菌门（包括658个属），7个真菌门（包括156个属），并且在7个轮次发酵过程中核心微生物群为Bacillu、Lentibacillus、Kroppenstendtia、Oceanobacillus、Lactobacills、Thermomyces、Byssochlamys、Thermoascus等。李小龙[35]运用扩增子测序技术研究芝麻香型白酒发酵微生物群落，结果表明其优势属包括Lactobacillus、Bacillus、Pichia、Saccharomyces、Aspergillus、Wickerhamomyces和Geotrichum，然后选择丰度和分布具有差异的微生物强化发酵酒醅并应用到窖池，结果乙酸乙酯等10种重要挥发性化合物含量提高，使得酒体的口感质量提高，但并未破坏酒体的整体风味轮廓。

宏基因组测序技术不需要特异性扩增，直接对样本中所有存在的DNA进行测序，进一步开展物种识别鉴定和基因功能研究。它可以直接获取DNA水平的基因功能注释，因此，相对于扩增子技术而言，宏基因组的随机测序更有利于研究实际检测样本中微生物的功能。Tao等[36]对浓香型白酒窖泥进行宏基因组测序分析，得到了己酸合成途径中的关键酶，并构建了Clostridium、ClostridialclusterIV、Methanoculleus和 Methanosarins的己酸合成途径。于学健等[37]对芝麻香型高温大曲的高温放线菌进行宏基因组测序，揭示了高温放线菌及其功能基因与大曲理化性质的关系，结果表明高温放线菌的丰度上升，碳水化合物降解相关基因逐渐富集，促进大曲糖化力与酯化力提升。

宏转录组测序有别于宏基因组，以DNA为研究对象，它是对样本中存在的RNA进行测序。宏转录组测序获得的是活性物种、表达中的活性基因和活性功能等信息。活性微生物会根据生理及环境的变化调节自身的基因表达和功能发挥，因此，宏转录组测序对于复杂微生物群落的动态活性研究具有重要意义。宋哲玮等[27]运用内转录间隔扩增子和宏转录组测序对酱香型白酒发酵过程进行了研究，结果表明酱香型白酒发酵过程涉及10个属的酵母微生物，且Pichia kudriavzevii和Schizosaccharomyces pombe是酱香型白酒发酵过程中的优势酵母。田源等[28]运用宏转录组测序分析研究浓香型窖池内微生物的正丙醇合成途径，结果表明浓香型窖池内有2-甲基苹果酸代谢途径、苏氨酸代谢途径和丙酸代谢途径，且真菌主要通过前两种途径合成正丙醇，而细菌主要是通过后一种途径。

4 其它分析方法

Biolog微平板法是专门为复杂样品的细菌群落分析而创建的，相比于传统的平板计数方法，它更能反映微生物群落的生态活性情况。它们包含多种生态碳源，不同的微生物可以使用不同的碳源来支持其不同的代谢功能，因此，Biolog微平板可潜在地用于分析微生物群落状态。李浩等[38]采用Biolog微平板法对浓香型大曲微生物多样性进行研究，发现该大曲微生物根据Biolog反映的特征性图纹可分为5类。

磷脂脂肪酸法（phospholipid fatty acids，PLFA）是一种根据样品中磷脂的信息来反映微生物的生物量，从而反映微生物的演替情况的方法。因此，它能快速反映出微生物是否受到环境微生物的影响变化，能提供更多表型和生物活性信息。张红霞[23]运用PLFA对3种清香型白酒大曲中微生物群落结构进行了解析，发现微生物种类及含量在3种大曲中呈现出较大差异。

5 白酒酿造微生物与风味化合物的关联性分析

酿造微生物对于白酒生产的主要贡献为通过繁殖代谢，将谷物等原料转化为乙醇和各种风味物质。在进行酿造微生物的代谢特性研究时，研究者们通常对分离筛选的微生物进行单菌发酵、混菌发酵或者将其应用到制曲，并在发酵过程中作为强化剂进行添加来研究其对白酒风味的影响。不管是白酒酿造微生物群落研究，还是风味物质研究，都会产生大量的样本信息数据，包括其含量、种类等。因此，在纷繁复杂的数据中将酿造微生物与其发酵体系中的风味成分进行科学的分析和关联，是研究微生物对白酒风味影响的一个重要环节。

运用统计学分析方法可以更好地对数据进行排序、分类、建立联系，如表2所示。

表2 微生物与风味化合物关联性研究中的统计分析方法Table 2 Statistical analysis methods in the research of the correlation between microorganisms and flavor compounds

续表2 微生物与风味化合物关联性研究中的统计分析方法Continue table 2 Statistical analysis methods in the research of the correlation between microorganisms and flavor compounds

排序分析可以从大量的数据中提取出主要信息，在分析白酒酿造微生物和风味化合物时应用广泛，常用的排序分析方法有主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）等。刘凡等[25]运用主成分分析和偏最小二乘回归对洋河酒厂浓香型白酒发酵过程中微生物与主要有机酸进行分析，得到了Lactobacillus、Staphylococcus、Saccharomyces、Naumovozyma、Issatchenkia、Psychrobacillus和Rhizopus这7种与主要有机酸合成的关键微生物。Liu等[40]将糯米酒酿造过程中不同阶段的挥发性化合物和微生物群落分别进行PCA分析和PCoA分析，可以清楚地观察到发酵过程中主要的40种化合物和24个样本中细菌、真菌类群落的动态变化。聚类分析是一种常用的数据分类方法，热图、树形图都是常见的通过聚类分析而将数据进行分类并且可视化的表示方式。腾军伟等[13]利用层级聚类分析将不同酵母固液态发酵的挥发性产物绘制成树形图进行可视化比较，直观清楚地展示了不同酵母的代谢产物及产量的异同。

相关性与回归分析在微生物和风味化合物研究中，能将众多不同类型之间的变量或数据建立联系或区分。偏最小二乘回归分析法适用于多变量之间建立联系，常用于研究复杂发酵体系中具体微生物与风味物质之间的相关性。Kong等[44]研究酵母菌的代谢作用时，运用偏最小二乘回归分析，得到了8种酵母菌与16种风味物质之间的关联性，如异常毕赤酵母与乳酸乙酯、十四酸乙酯等物质的生成有关。微生物关联网络也是常用的在微生物与微生物、微生物与风味化合物之间进行相关系数计算，并构建网络图来展示相互关系的处理方法。Liu等[40]根据Pearson相关系数，在古田红曲糯米酒酿造过程中核心微生物和主要化合物之间建立关联网络，表征了40种主要挥发性化合物和20种核心真菌、细菌之间的高度相关关系，包括44对高度正相关和9对高度负相关关系。

由此可见，在微生物群落研究、风味化合物研究及探寻酿造微生物与风味成分形成之间的关系时，统计学分析是一项非常有效的、关键的处理方法。合理科学地运用统计学分析可以对数据进行更好地挖掘和多方面评估，从而让试验结论更加科学全面。

6 总结与展望

白酒酿造微生物的研究是一项复杂且具有重大意义的工作，对白酒酿造微生物的分离鉴定及群落结构分析方法、白酒酿造微生物与风味化合物的关联性分析方法进行综述，可以为白酒酿造微生物的系统研究提供参考，以此来更好地为白酒质量的提升打下基础。白酒酿造微生物的研究不仅是要分离鉴定更多的微生物，了解微生物的区系结构及动态变化情况，还要分析其生理特点、代谢途径、代谢产物等功能特性，如此才能分析白酒的风味产生机理，将白酒酿造微生物的研究成果应用到白酒的风味品质提升上。随着高通量测序及质谱技术的发展，白酒酿造微生物的研究更深入、高效和全面。宏转录组学、宏基因组学、蛋白质组学和代谢组学等方法可以综合运用，在明确微生物的种类、群落结构的动态变化的基础上，挖掘更多的功能基因，探寻微生物内的代谢通路、合成风味化合物有关的关键酶，构建白酒酿造微生物功能基因库，了解微生物之间的相互作用关系，为白酒酿造微生物的代谢调控及定向选育提供理论基础，进而将微生物理论研究转化为应用研究，从而促进白酒酿造微生物的产业化应用及白酒酿造技术的升级。