食品中水溶性维生素测定方法的研究现状

相坛坛，王明月，吕岱竹，郭建峰，梁水连，戎瑜，周佳

（1.中国热带农业科学院分析测试中心，海南 海口 571101；2.中北大学化学工程与技术学院，山西 太原 038507）

维生素是维持人和动物身体健康所必需的一种有机化合物，人体自身不能合成，必须从外界环境摄取。水溶性维生素作为维生素重要的一部分，对维持人体的正常生命活动极为重要。如维生素C主要参与人体内的羟化反应及氧化还原反应；维生素B1以辅酶的形式参与人体内能量与营养素的代谢；维生素B2主要参与体内能量代谢；维生素B6在人体内主要参与氨基酸的合成与分解代谢，催化血红蛋白合成，促进肌肉与肝中的糖原转化等；叶酸对体内红细胞的合成有着重要的作用。水溶性维生素主要存在于粗粮、动物肝脏、蔬菜等食物中[1]，包括维生素C（VC）、维生素B1（VB1）、维生素B2（VB2）、维生素B3（VB3）、维生素B5（VB5）、维生素B6（VB6）、维生素B7（VB7），维生素B9（VB9）和维生素B12（VB12），当人体内的水溶性维生素不足或过量都会导致许多疾病发生[2]。

水溶性维生素很不稳定，在酸、碱、光、热等条件下会发生降解，因此对其分析测定有些困难。传统的分析方法包括微生物法、分光光度法，随着现代分析测试技术的快速发展，水溶性维生素的检测方法也变得更加丰富，超临界色谱法、高效液相色谱法、液相-质谱联用法等多种方法也被应用于水溶性维生素的检测中，本文就近十年来现代分析测试技术在水溶性维生素测定方法中的应用进行了简单综述[3-6]。

1 水溶性维生素的检测方法

1.1 微生物法

微生物法测定水溶性维生素含量是一种最常见的水溶性维生素检测方法，是利用微生物的特异性，给予一定的营养条件或改变微生物的生存环境，通过其生长繁殖和代谢表达来完成对单一维生素成分的测定。

早在20世纪五十年代，英国维生素研究专家就利用微生物对来自不同动物的奶样中的维生素B12含量进行了测定。我国学者于上世纪90年代开始使用微生物对食品中的维生素含量进行测定，经过近30年不断的革新发展，微生物法测定维生素已非常成熟，在2017年颁布的国家标准中，利用微生物法分别对食用农产品中的烟酸和烟酰胺、泛酸、吡哆素、生物素及叶酸进行了测定。

利用微生物对维生素进行测定，微生物本身对生存环境极为敏感，且其特异性表达决定了微生物法检出限低、灵敏度高、结果可靠的优点，但同时也因为微生物易染菌、特异性强造成了其具有培养周期长、重现性差、测定结果单一等缺点。刘冬虹等[7]优化建立微生物法快速测定婴幼儿配方乳粉中的维生素B12、叶酸、生物素、肌醇4种水溶性维生素的方法。该方法利用甘油保护菌种，节省菌种制备时间，简化试验操作，同时菌种活力更稳定，保证了试验的有效性；采用1.2mL PP小管和移液器进行操作，减少了大量移液管、玻璃器具的使用，节省了大量时间。该方法解决了传统微生物法试验周期长、操作复杂的问题。刘志楠等[8]用乳酸杆菌完成了牛奶中泛酸含量的测定，其在对泛酸含量测定时，应用了泛酸试剂盒，极大缩短了检测时间。各种维生素检测试剂盒因其简单快速的优点必然将成为检测维生素含量的一种不可或缺的工具。

微生物法是检测维生素含量最简单、最普遍的一种方法，在未来的发展中应该着力于其较差的重现性及检测单一性等方面，从而使该方法更加完善。

1.2 光度法

光度法也是检测水溶性维生素的一种常用方法，主要分为分光光度法和荧光光度法。

分光光度法利用水溶性维生素对紫外光有极强的吸收的特点，测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度。光度法对水溶性维生素的定性和定量分析，相对于微生物法，有灵敏度高、操作简便快速、成本低的优点。叶群利等[9]利用分光光度法完成了黄果柑中维生素C的测定，以抗坏血酸标准品为对照品，于420 nm波长处测定吸光度值，结果准确、回收率好。但分光光度法在实际操作中过程繁琐，花费时间较长，且在测定时有过多的干扰项，稳定性差。

分子荧光法有灵敏度高，检出能力强的优点，一般用于自身含有荧光基团或者衍生后能有荧光特性的物质，国标中维生素B1、维生素B2、泛酸、烟酰胺等都采用了荧光光度法。光度法的缺点在于前处理复杂，维生素往往要经过提取、皂化衍生化等步骤，且不同的维生素往往前处理方法不同，不具备高效快速的特点。

1.3 毛细管电泳法

高效毛细管电泳法起步于20世纪80年代末，是近年来发展最快的分析方法之一。它是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。

毛细管电泳法具有高效、快速、分析对象广的优点，近年来有许多学者利用其对水溶性维生素进行了测定。柯月娇等[10]建立了高效毛细管电泳同时测定5种水溶性维生素的方法，该方法在6 min内可以对5种水溶性维生素进行分离，以出峰时间进行定性、峰面积进行定量，对食品中的维生素进行定性定量分析。尤慧艳[11]采用毛细管电泳法对常见的8种水溶性维生素的快速分离分析电泳条件作了比较深入的探讨，通过双模对接高压电源，实现了40 kV以上的超高压，并通过优化其它条件，保证了系统稳定性，在2.2 min内成功地分离了维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素B5、生物素，烟酸和叶酸8种水溶性维生素，为研究水溶性维生素的检测方法提供了新思路。但毛细管由于其直径较小，所以检测时灵敏度相对较低；电渗也会受到样品成分的影响，重现性不好。

1.4 液相色谱法

色谱分析是按物质在固定相与流动相间分配系数的差别而进行分析、分离的方法，相较于传统的分析测试方法，色谱法有着更短的检测时间，更高的检测效率，更准确的检测结果等优点[12]。高效液相色谱用高压输液系统，以液体为流动相，将具有极性不同的单一溶剂或者比例不同的混合溶液等流动相输送入装有固定相的色谱分析柱，在柱内进行分离分配，进入合适的检测器完成对试样的分析测试，其较普通液相色谱具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，且色谱柱可反复使用，样品在短时间内可以回收[13]。

水溶性维生素是维持人体生命活动必不可少的重要化合物之一，与人体的健康机能息息相关，高效液相色谱法是目前测定水溶性维生素最普遍的方法，国内外已有许多方法对其进行测定。任丹丹等[14]建立了同时测定食品中9种维生素的高效液相色谱分析方法，该方法能同时对维生素C、硫胺素、核黄素、烟酰胺、吡哆醇、泛酸、生物素、叶酸和氰钴胺9种水溶性维生素进行检测，线性相关系数为0.999 7～0.999 9，相对标准偏差为0.28%～1.35%，检出限范围为3 ng/mL～45 ng/mL，加标回收率为90.6%～105.4%。郭建博等[15]建立一种快速测定10种水溶性维生素的超高液相色谱的检测方法，该方法能够在10 min内完成10种水溶性维生素的测定，10种水溶性维生素在该方法下线性关系良好（r＞0.999），精密度（relative standard deviation，RSD）值小于2%。Saad等[16]建立了快速测定多种食品中水溶性维生素的方法，该方法成功地应用于7种水溶性维生素的混合物的分析，平均回收率为98.14%～100.96%。用液相色谱对水溶性维生素进行检测可实现高效快速的目的，但在实际测定中，还需从维生素本身出发考虑一些问题。

水溶性维生素种类多，不同种类的水溶性维生素其理化性质也有很大的差异。不同种类的水溶性维生素在溶液及光、热、空气中的稳定性见表1。

表1 不同种类的水溶性维生素在溶液及光、热、空气中的稳定性Table 1 Stability of different kinds of water-soluble vitamins in solution，light，heat and air

林江丽等[17]建立了高效液相色谱同时测定SO2处理前后无核葡萄干中4种水溶性维生素的分析方法，结果表明，用SO2处理对葡萄干中维生素B1的含量影响最大，其他3种B族维生素的含量变化不大。Kim等[18]建立离子对试剂测定和定量动物饲料中6种水溶性维生素的方法，表明利用离子对试剂对维生素的分离及测定会有较大的影响。这些文献都表明在对维生素进行提取时应注意到提取溶剂可能对维生素的含量造成一定的影响，要选择合适的提取溶剂对维生素进行提取，选择合适的流动相对维生素进行分离。

水溶性维生素因其含有如羟基、醛基、共轭双键等生色基团，对紫外光有良好的吸收度。在检测中，通常用紫外检测器对其进行分析测定。薛淼等[19]通过高效液相色谱法在波长为266 nm下分别测定了4种茶叶中维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素C和烟酸的含量，为茶叶加工品质控制及研究维生素在茶叶加工过程中的变化提供一种检测方法。王雪梅等[20]采用高效液相色谱法在254 nm的波长下同时测定了新鲜草莓中维生素C、维生素B1、维生素B2和烟酸的含量，其回收率为96.1%～107.7%，变异系数为0.912%～1.56%。Rejaul[21]利用紫外检测器在13 min内分离测定了8种水溶性维生素，其回归系数r＜0.993，精密度0.3%～2.77%，准确度83%～124%，这些文献都表明应用紫外检测器对维生素进行分离测定具有很大的优势。水溶性维生素的紫外最大吸收波长见表2。

表2 水溶性维生素的紫外最大吸收波长Table 2 Maximum UV absorption wavelength of water-soluble vitamins

当然，对水溶性维生素的检测不仅仅局限于紫外检测器，许多学者也用了其他检测器对水溶性维生素进行了测定，Anna等[22]通过高效液相色谱-光电二极管阵列-荧光法在30 min内分离测定了功能饮料中13种水溶性维生素的含量，以及维生素补充剂的含量。Swen等[23]采用紫外-二极管列阵-荧光法依次对6种水溶性维生素的含量进行了测定。在维生素的实际测定中，不能局限于一种检测器，可适当应用不同的检测器对其进行测定。

液相色谱法在维生素含量的测定中作用显著，在以后的实际应用中，应结合液相色谱的优势及维生素的理化性质开发出更多、更简、更优的检测方法。这对检测维生素的含量、研究不同种类维生素的作用、维生素的提取利用都将有很重要的意义。

1.5 液相色谱-质谱法

液相色谱-质谱联用作为近些年出现的一种新的分析检测方法，为食品和医疗等领域的分析检测技术提供了更广阔的发展前景。液相色谱-质谱分析将色谱的高效迅速和质谱的高灵敏度、强定性力有效结合起来，可以同时对多种不同样品进行定性及定量分析[24-25]。其先利用高效液相色谱对不同样品进行有效的分离，然后利用质谱检测器所具有的高专一性、高选择性、高灵敏度对不同样品进行分析测定[26]。Hubo等[27]建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定烟草制品中咖啡因、牛磺酸和5种水溶性维生素（维生素B1、维生素 B2、维生素 B3、维生素 B9、维生素 B12）的方法，线性系数大于0.997，回收率为95.1%～102.8%，该方法可用于批量测定和检测烟草制品中水溶性维生素的含量。施煜等[28]建立液相色谱-质谱法快速测定运动饮料中维生素B1、维生素B2、泛酸、维生素B6、生物素、叶酸、维生素B12、烟酸、烟酰胺9种水溶性维生素的方法。相关系数大于0.999，回收率为90%～102.3%，该方法适用于运动饮料中维生素的测定。宁霄等[29]建立超高效液相色谱-串联质谱检测方法同时测定保健食品中10种水溶性维生素，10种水溶性维生素在6 min内完成分离，线性相关系数大于0.997，回收率为85.9%～109.5%，该方法适用于保健食品中维生素的测定。水溶性维生素的质谱检测参数见表3。

表3 水溶性维生素的质谱检测参数Table 3 Parameters of water-soluble vitamins by mass spectrometry

液质联用在实际使用中会产生基质效应从而影响结果的准确度。基质效应是指色谱分离时供洗脱的物质改变了待测成分的离子化效率，从而引起信号的抑制或提高，很大程度上破坏了结果的稳定性及重现性。通过改善样品前处理方法、改善色谱条件、改善离子化方式、减小进样量等方法可以减小基质效应。詹越城等[30]建立了食品中牛磺酸、维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、叶酸、维生素B12、生物素12种水溶性维生素含量的高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法较好地减少了基质效应的影响，有极好的准确性和高灵敏度。边丽娜[31]通过建立一种高效液相色谱-串联质谱检测法，对婴幼儿配方食品中的11种水溶性维生素进行同步检测。该方法通过优化色谱条件减少了基质效应对结果的影响，对于实验室提高食品检测效率有着重要意义。

利用液相色谱-质谱测定水溶性维生素时应通过不断优化色谱条件、优化前处理过程使水溶性维生素检测流程更简便、检测准确性更好、检测灵敏度更高。

1.6 超临界色谱法

超临界流体色谱法也是近年来发展较为迅速的一种检测方法，以超临界流体作为流动相的一种色谱方法。超临界流体指的是流体在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态，它具有低黏度、高密度及较高的扩散系数等特性。超临界流体色谱既可以分析气相色谱法难以处理的高沸点、不挥发样品，又有比液相色谱法更高的柱效和更短的分析时间。理论上讲，其应用于维生素的定性、定量分析也应更加方便。张春兰等[32]采用超临界流体色谱快速测定了复合维生素中3种维生素含量；线性关系良好，平均回收率介于97.3%～104.8%。竹宏等[33]利用超临界流体色谱法建立同时测定维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B64种水溶性维生素的方法，试验结果表现出高效、快速，重现性和稳定性高的优点。这些试验证明了超临界流体色谱测定水溶性维生素的可行性，为进一步利用超临界流体色谱测定水溶性维生素提供了思路。

超临界色谱应用于维生素检测时，相对于其他方法具有更高的检测效率，更短的检测时间，但由于有些水溶性维生素的极性限制难以使用超临界色谱对其进行测定。

2 水溶性维生素检测方法比较

伴随现代分析测试技术的发展，水溶性维生素检测方法也越来越多样化。现阶段对水溶性维生素的检测主要使用液相色谱法，微生物法和光度法也有使用。国家标准中规定了一些水溶性维生素的检测标准，例如在对食用农产品烟酸和烟酰胺的测定标准中，规定了微生物法和高效液相色谱法2种方法，其中微生物法的检出限为50 ng/mL～500 ng/mL，液相色谱法的检出限为烟酸 30 μg/100 g，烟酰胺为 40 μg/10 g。毛细管电泳法和超临界色谱法对水溶性维生素进行检测在近些年也多有报道。不同水溶性维生素检测方法优缺点对比见表4。

表4 不同水溶性维生素检测方法优缺点对比Table 4 Comparison of advantages and disadvantages of different water-soluble vitamin detection methods

表4对近年来水溶性维生素的检测方法的优缺点进行了对比，以方便针对不同检测需求选择合适的检测方法。

3 展望

当今，人们已经越来越重视健康问题，水溶性维生素作为维持人体生命健康的一种极为重要的有机化合物，已被越来越多的人关注和重视。虽然已经可以利用液相色谱-质谱等方法对维生素进行定性定量分析，但在国标方法中对维生素的测定方法还未更新，且没有一个完整有效的包含多种维生素的检测标准，对检测标准的更新和拓展应作为水溶性维生素检测的一个研究方向。同时，检测的应用面也应予以扩大，将维生素检测方法应用于饲料、水果、药品、饮料、发酵乳制品，以及人体新陈代谢物的研究，这对食品健康与品质的提升，人体健康发育都有着极其深远的意义[34-38]。

近年来，由于各种高新材料及高新技术的发展，全球科学仪器产生天翻地覆的变化，给分析测试的发展带来了广阔的前景，这也意味着水溶性维生素的检测方法和手段也将越来越先进。在未来，采用基因层次技术、纳米级材料对维生素进行提取，分子层次的剖析以及全球网络的成果共享必然使水溶性维生素的检测向更微量、过程更高效、结果更精密的方向发展，也会使检测应用面更广。