石榴果酒澄清剂的筛选及澄清工艺优化

韩希凤，李书启，陈存坤，王俊全*，盖旭，陈玲

（1．天津天狮学院 食品工程学院，天津 301700；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），农业部农产品贮藏保鲜重点实验室，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384）

石榴不仅含有人体所需的多种氨基酸和微量元素，还含有大量维生素、蛋白质、碳水化合物等营养物质，具有抗疲劳、生津止渴、食疗保健等功能[1-2]。最初，石榴主要是鲜食。但近年来，随着我国石榴种植面积上升，产量不断增加，而鲜销量有限，石榴深加工相对滞后，造成鲜果大量浪费。以石榴汁为原料，经发酵、陈酿制成的低度的石榴果酒[3]，果香浓郁、营养丰富，将石榴加工成果酒不仅丰富了石榴深加工产品的种类，提高了石榴的利用率和附加值，同时与国家用低度酒代替高度酒、果酒代替粮食酒的号召相辅相成，是石榴深加工的一条新途径。然而，发酵后的石榴果酒颜色较深，并含有果胶、鞣酸等大分子物质，后期陈酿时这些物质易絮凝沉淀，导致酒体浑浊，严重影响果酒的品质[4-6]。

果酒澄清最常用的方法是加入澄清剂，且同一种澄清剂对不同果酒的澄清效果也不同[7-8]。皂土、壳聚糖、明胶、果胶酶等是目前果酒生产中常用的澄清剂，选择适宜的澄清剂可有效去除易造成浑浊沉淀的物质，使果酒具有良好的感官指标和稳定性[9]。如李德燕等[10]对比壳聚糖、皂土、交联聚乙烯吡咯烷酮、明胶、硅藻土和果胶酶6种澄清剂对酥李果酒的澄清效果，发现利用最适用量的不同澄清剂澄清酒液，其感官品质均有显著提高，但壳聚糖澄清的酥李果酒，其澄清速率和稳定性最佳，是酥李果酒的最适澄清剂。

然而，迄今为止专门针对石榴果酒澄清剂筛选及其工艺优化的相关研究鲜有报道。由此，本试验采用4种不同的澄清剂（壳聚糖、明胶、皂土和果胶酶）对石榴果酒进行澄清处理，通过对澄清后酒样的理化指标、澄清度等进行分析，并结合感官评价，探索适合石榴果酒的澄清剂并利用正交试验对其工艺条件进行优化，以期为石榴果酒的加工提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴果酒：天津天狮学院果蔬制品工艺实验室自制（市售陕西酸石榴，按照葡萄酒标准酿造工艺正常发酵，于酒罐贮存1个月，取上清液进行澄清试验）。

皂土（食品级）、果胶酶（食品级，酶活＞40000U/mg）：烟台帝伯士自酿机有限公司；明胶（食品级）、壳聚糖（食品级，脱乙酰度85%）：浙江一诺生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

全自动测色色差计（TCPⅡ）：北京奥依克光电仪器有限公司；数字阿贝折光仪（WAY-2S型）：上海仪电物理光学仪器有限公司；紫外分光光度计（UV2550）：日本岛津公司；高温灭菌锅（MJ-78A型）：上海恰森仪器有限公司；生物传感器（SBA-40C）：山东省科学院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 石榴果酒的制作工艺流程

无籽石榴→挑选→去皮→加水打浆 [料液比1∶3（g/mL）]→果胶酶酶解（果胶酶用量 2%，4 h）→成分调整（糖度16%，pH4.5）→灭菌（沸水浴 15 min）→冷却→酵母菌活化→接种→发酵（28℃，7 d）→陈酿→澄清→过滤→灌装→杀菌→成品

1.3.2 澄清剂的配制

1%壳聚糖溶液：参照郭燕等[11]的方法配制；1%明胶溶液：参照李亚辉等[12]的方法配制；1%皂土溶液（悬浊液）参照邵晓庆等[13]的方法配制；1%果胶酶溶液：参照饶炎炎等[14]的方法配制。

1.3.3 石榴果酒澄清剂筛选试验

取石榴果酒50.00 mL，24份，将壳聚糖、明胶、皂土、果胶酶分别加入果酒中（添加量见表1），混匀，20℃静置10 h后，4 000 r/min离心15 min，取上清液，测定A720，计算石榴果酒的澄清度。澄清度/%=10-A720×100[15]。

表1 4种澄清剂澄清试验设计Table 1 Experimental design of four clarifiers

1.3.4 皂土澄清单因素试验设计

1.3.4.1 皂土添加量

取5份石榴果酒，各50.00 mL，皂土溶液分别按照0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L 加入果酒中，混匀，20 ℃静置10 h 后，4 000 r/min 离心 15 min，取上清液，测定 A720，计算澄清度。

1.3.4.2 处理温度

取5份石榴果酒，各50.00 mL，皂土溶液以0.7 g/L加入果酒中，混匀，分别于 10、15、20、25、30 ℃静置10 h 后，4 000 r/min 离心 15 min，取上清液，测定 A720，计算澄清度。

1.3.4.3 处理时间

取5份石榴果酒，各50.00 mL，皂土溶液以0.7 g/L加入果酒中，混匀，于 20 ℃分别静置 5、10、15、20、25 h后，4 000 r/min 离心 15 min，取上清液，测定 A720，计算澄清度。

1.3.5 皂土澄清条件的优化

在单因素试验基础上，以澄清度为指标，以皂土添加量（A）、处理温度（B）、处理时间（C），设计三因素三水平L9（34）的正交试验，对皂土的澄清条件进行优化，因素与水平见表2。

表2 因素水平Table 2 Factors and level

1.3.6 理化指标的检测方法和感官评价标准

色度：参照曹建康等[16]的方法测定；色差：参照周禹含等[17]的方法测定；可溶性固形物含量：利用阿贝折光仪测定，重复3次，取平均值；酒精度：参照韩希凤等[18]的方法进行测定。

感官评价：石榴果酒评分标准如表3所示。该标准由14名专业人员组成的感官评价小组参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》共同制定。感官评价小组成员对果酒进行评价打分（满分为100分），取平均值作为试验结果。

表3 石榴果酒感官评定标准Table 3 Sensory evaluation standard of pomegranate wine

1.4 数据处理

利用SPSS 22.0进行差异显著性检验，采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 石榴果酒澄清剂的筛选

2.1.1 明胶添加量对石榴果酒的澄清效果

明胶添加量对石榴果酒澄清效果的影响见图1。

由图1可知，随着明胶添加量增加，石榴果酒的澄清度整体上呈先增大后减小的趋势，在明胶添加量为0.9 g/L时澄清效果最佳，澄清度为80.9%，之后，随明胶添加量增加，石榴果酒的澄清度整体下降，这是因为明胶作为水溶性蛋白质，在水溶液中形成的分散体系带正电荷，一方面可与果酒中单宁、果胶等带负电的化合物絮凝沉淀，一方面可与酒中单宁结合成黏稠状物质，吸附果酒中的浑浊微粒沉淀，使酒体澄清[19]；但过量的明胶自身会形成絮状体或悬浊液，导致酒体浑浊[20]。由此，明胶添加量为0.9 g/L时对石榴果酒的澄清效果最好。

图1 明胶添加量对石榴果酒澄清效果的影响Fig.1 Effects of different gelatin addition on clarification for pomegranate wine

2.1.2 壳聚糖添加量对石榴果酒的澄清效果

壳聚糖添加量对石榴果酒的澄清效果的影响见图2。

图2 壳聚糖添加量对石榴果酒澄清效果影响Fig.2 Effects of different chitosan addition on clarification for pomegranate wine

由图2可知，随着壳聚糖添加量增加，石榴果酒澄清度整体上先升后降，壳聚糖添加量为0.6 g/L时效果最好，澄清度达到94.8%，说明壳聚糖添加量适当时，可提高果酒澄清度，这与壳聚糖本身是阳离子絮凝剂，可与单宁、果胶、蛋白质等带负电荷物质凝聚、沉淀有关[21]；但壳聚糖超过一定量时反而使果酒澄清度下降，这可能是因为壳聚糖也是增稠剂，过量的壳聚糖溶解于果酒会形成相对稳定的絮凝体系，而对酒体澄清不利。由此，壳聚糖添加量为0.6 g/L时对石榴果酒的澄清效果最好。

2.1.3 皂土添加量对石榴果酒澄清效果的影响

皂土添加量对石榴果酒澄清效果的影响见图3。

由图3可知，随着皂土添加量增加，果酒澄清度整体上先升后降，皂土添加量为0.6 g/L时澄清效果较好，澄清度为97.7%，说明适量的皂土能与果酒中部分浑浊物以及带颜色物质发生絮凝沉淀，但过量的皂土会自身交替形成悬浊液，而不利于石榴果酒澄清。皂土是由硅酸盐薄片组成的无机矿物凝胶，吸收水溶胀后，形成的胶体悬浮液带负电荷，致使果酒中带正电荷的蛋白质和单宁等物质通过电荷中和作用絮凝沉淀，从而使酒体澄清[22-23]。由此，皂土添加量为0.6 g/L时对石榴果酒的澄清效果最好。

图3 皂土添加量对石榴果酒澄清效果影响Fig.3 Effects of different bentonite addition on clarification for pomegranate wine

2.1.4 果胶酶添加量对石榴果酒澄清效果的影响

果胶酶添加量对石榴果酒澄清效果的影响见图4。

图4 果胶酶添加量对石榴果酒澄清效果影响Fig.4 Effects of different pectinase addition on clarification for pomegranate wine

由图4可知，石榴果酒的澄清度随着果胶酶添加量的增加先升后降。当果胶酶添加量为0.3 g/L时，澄清效果最好，澄清度可达80.4%。果胶酶添加量高于0.3 g/L时，果酒的澄清度开始下降，这与过多酶蛋白引起果酒浑浊有关。

2.1.5 不同澄清剂对石榴果酒澄清效果的比较

在适宜添加量下，分析了4种澄清剂（果胶酶、壳聚糖、皂土、明胶）对石榴果酒澄清效果的影响，结果见表4。

表4 石榴果酒澄清前后的比较分析Table 4 Analysis of pomegranate wine before and after clarification

由表4可知，壳聚糖和皂土澄清的果酒澄清度均在90%以上，澄清效果相近；果胶酶和明胶的澄清效果较差。同时，添加澄清剂的果酒，其可溶性固形物含量、色度、色差都低于未添加澄清剂的样品，而皂土处理的果酒，感官评分最高，为86.8分，酒精度与未澄清的果酒最接近，效果优于壳聚糖澄清，且所得果酒澄清透明、颜色鲜亮、口感好。因此，皂土为石榴果酒的适宜澄清剂。

2.2 皂土澄清石榴果酒条件的优化

2.2.1 单因素试验结果

皂土添加量、处理温度、处理时间单因素试验结果分别见图5、图6、图7。

图5 皂土添加量对石榴果酒澄清效果影响Fig.5 Effects of different bentonite addition on clarification for pomegranate wine

图6 处理温度对石榴果酒澄清效果影响Fig.6 Effects of different tempreture on clarification for pomegranate wine

图7 处理时间对石榴果酒澄清效果影响Fig.7 Effects of different time on clarification for pomegranate wine

由图5、图6、图7可知，皂土添加量、处理温度、处理时间对石榴果酒澄清度的影响均为整体上先升后降，皂土添加量0.7 g/L时，澄清效果最好，果酒澄清度达到最大值94.8%；处理温度20℃时，果酒的澄清度达到最大值95.5%；处理时间为10 h时，果酒的澄清度达到最大值97.7%。

2.2.2 正交试验

2.2.2.1 正交试验分析

在单因素试验基础上，以澄清度为指标，以皂土添加量（A）、处理温度（B）、处理时间（C）设计三因素三水平L9（34）的正交试验，对皂土的澄清条件进行优化，结果见表5，方差分析结果见表6。

表5 正交试验结果Table 5 Results of orthogonal test

由表5和表6可知，3个因素对石榴果酒澄清度的影响顺序为B＞A＞C，即处理温度＞皂土添加量＞处理时间，且皂土添加量和处理温度的影响显著（P＜0.05），处理时间影响不显著。其最优方案为A2B1C1，即皂土添加量为0.70 g/L，处理温度为18℃，处理时间为8.0 h。

表6 方差分析结果Table 6 Results of variance analysis

2.2.2.2 验证试验

方案1（正交试验理论最佳组合）：皂土添加量0.70 g/L，处理温度18℃，处理时间8.0 h。方案2（正交试验实际最佳组合）：皂土添加量为0.70 g/L，处理温度为18℃，处理时间为10.0 h。对方案1和方案2进行验证试验，结果见表7。

表7 验证试验结果分析Table 7 Analysis of verification test results

由表7可知，方案1澄清后的果酒，其可溶性固形物含量、色差、色度及酒精度均优于方案2，感官评分优于方案2，因此，最佳澄清工艺条件为方案1，即皂土添加量为0.70 g/L，处理温度为18℃，处理时间为8.0 h。

3 结论

通过4种澄清剂的筛选试验，发现对石榴果酒的澄清效果最好的为皂土，其次是壳聚糖，果胶酶和明胶的较差。同时，添加澄清剂的石榴果酒，其可溶性固形物含量、色度、色差都低于未添加澄清剂的样品；而皂土澄清的石榴果酒，其各项指标均高于壳聚糖澄清，且酒精度与未澄清的果酒相近，感官品质较佳。因此，皂土为石榴果酒的适宜澄清剂。

在单因素试验基础上，以澄清度为指标，通过正交试验对皂土澄清工艺条件进行优化，结果表明：3个因素对石榴果酒澄清度的影响顺序为处理温度＞皂土添加量＞处理时间，且皂土添加量和处理温度的影响显著（P＜0.05），处理时间影响不显著。经验证试验，最优方案为A2B1C1，即皂土添加量为0.70 g/L，处理温度为18℃，处理时间为8.0 h。此时果酒的澄清度为最高达98.9%，感官评分88.2分，果酒清澈透明、均一稳定，呈鲜亮红色，品质较佳。