BRCA1、AR及Ki-67在三阴性乳腺癌中的表达及临床病理意义

张 科 刘志良 陈雪琴 唐 牧 蔡 勇 黄传生

乳腺癌是威胁全球女性健康的主要恶性肿瘤之一，同时它也是1种激素依赖性的异质性疾病，其分子分型已成为近年的研究热点。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)以及人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)均表达阴性的一类特殊亚型乳腺癌。与其他亚型乳腺癌相比较，三阴性乳腺癌侵袭性更强、预后更差。由于该类亚型乳腺癌缺乏有效的治疗靶点，目前仍以化疗作为其主要的治疗手段[1]。乳腺癌易感基因1 (BRCA1)是1种肿瘤抑制蛋白，通过在DNA修复、细胞周期阻滞和转录控制中发挥关键作用来维持基因组的稳定性[2]。雄激素受体(AR)是类固醇激素受体家族的一员，其在70%以上的乳腺癌和15%的TNBC中均有表达[3]，越来越多的证据支持AR在乳腺癌的发生发展中起着至关重要的作用，并与乳腺癌发病机制有关[4]。Ki-67 是由Gerdes 等[5]发现的1种与细胞有丝分裂周期密切相关的增殖细胞核抗原,可识别处在生长过程中正常细胞和肿瘤细胞,从而评估细胞的增生程度。其阳性表达能迅速可靠地反映恶性肿瘤的增殖率,并且该抗体与多种恶性肿瘤的发展、转移以及预后均有关。本次研究对象为三阴性乳腺癌，我们设想通过检测该亚型乳腺癌中BRCA1、AR及Ki67蛋白的表达情况，分析其三者之间的相互关系，探究三者与临床病理特征及预后的关系，为今后进一步探究三阴性乳腺癌的潜在治疗靶点打下基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月至2020年12月于江西省肿瘤医院收治住院的经免疫组织化学检测(ER、PR、Her-2等)确诊的三阴性乳腺癌患者94例，所有病例临床病理资料完整。均为女性患者，年龄32～78岁，中位年龄52.5岁；根据手术方式分为乳腺癌改良根治手术82例(87.3%)，乳腺单纯肿块切除术2例(2.1%)，乳腺肿块粗针穿刺活检10例(10.6%)；其中非特殊类型浸润性导管癌91例(96.8%)，具髓样特征的浸润性癌2例(2.1%)，分泌性癌1例(1.1%)。乳腺癌分子分型采用免疫组织化学(IHC)替代分型，即2013年St.Gallen乳腺癌会议国际共识[6]中关于三阴性乳腺癌(ER、PR及HER-2均阴性表达)的分型标准。

1.2 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学二步法，严格按照操作说明书进行实验。BRCAl抗体、AR抗体及Ki-67抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其他有关指标抗体及本次实验试剂均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。ER、PR染色结果判定标准：当≥1%的肿瘤细胞核呈现不同程度的着色时，即为阳性，反之则为阴性[7]；AR染色结果判定标准：≥10%的肿瘤细胞核呈现不同程度的着色时，即为阳性，反之则为阴性[8]；Her2染色阴性结果判定标准：无任何着色或任何比例的浸润性癌细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色；Ki67染色结果判定：胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，计数10个高倍视野肿瘤细胞中阳性细胞数，并计算阳性比率：<20%为低指数表达，≥20%为高指数表达；BRCA1染色结果判定标准：以肿瘤细胞胞质或胞核内出现棕黄色颗粒且数量>10%为阳性，≤10%为阴性。

1.3 统计处理

应用SPSS 23.0统计软件包进行实验数据的分析，BRCA1、AR及Ki67的表达与临床指标之间的关系分析采用校正的χ2Pearson检验，P<0.05为具有显著性差异；BRCA1与AR表达，BRCA1与Ki-67表达及AR与Ki-67表达之间相关性分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 BRCA1、AR及Ki-67蛋白在三阴性乳腺癌中的阳性表达率

BRCA1在三阴性乳腺癌中的阳性表达率为57.4%(54/94);AR在三阴性乳腺癌中的阳性表达率为35.1%(33/94)；Ki-67在三阴性乳腺癌中的阳性表达率为89.4%(84/94)。

2.2 BRCA1、AR及Ki-67表达与三阴性乳腺癌临床病理因素的关系

BRCA1蛋白、AR蛋白及Ki-67蛋白表达均与年龄无关，与发生肿块的部位(左侧或右侧乳腺)无关(P均>0.1)。见表1。

表1 BRCA1、AR、Ki67表达与临床病理特征的关系/例

2.3 BRCA1与AR的关系

Spearman相关性分析得出，BRCA1与AR在三阴性乳腺癌中的表达不相关，γ=0.182，P>0.05，见表2。

表2 BRCA1与AR表达在三阴性乳腺癌中的关系/例

2.4 BRCA1与Ki-67的关系

Spearman相关性分析得出，BRCA1与Ki67在三阴性乳腺癌中的表达呈负相关，γ=-0.279，P<0.05，见表3。

表3 AR与Ki67表达在三阴性乳腺癌中的关系/例

表3 BRCA1与Ki67表达在三阴性乳腺癌中的关系/例

2.5 AR与Ki-67的关系

Spearman相关性分析得出，AR与Ki67在三阴性乳腺癌中的表达呈负相关，γ=-0.252，P<0.05，见表4。

3 讨论

乳腺癌是1种激素依赖性的异质性疾病，对其分子分型的研究，已成为近年来众多学者关注研究的热点。根据乳腺癌组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(Her2)以及增殖细胞核抗原(Ki67)的表达情况，将乳腺癌分为4种亚型：即Luminal A型、Luminal B型、Her2过表达型和三阴性乳腺癌(TNBC)[9]。TNBC因其具有较高的复发率和病死率，预后较差，且目前尚无有效的内分泌及靶向治疗药物[1]，因此该亚型乳腺癌是当下研究的难点和热点。TNBC约占所有乳腺癌的15%，更常见于年轻女性和BRCA1突变携带者[10]。乳腺癌易感基因1 (BRCA1)，是1种肿瘤抑制蛋白，通过在DNA修复、细胞周期阻滞和转录控制中发挥关键作用来维持基因组的稳定性[2]，Paul等研究发现BRCA1/2蛋白的失调和表达改变会增强乳腺癌的偶发形式[11]，这表明通过检测BRCA1蛋白在乳腺癌中的表达情况可以在一定程度上提示肿瘤的进展，这一观点也与我们先前研究的关于BRCA1蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表达具有显著差异性不谋而合，联合检测BRCAl和Ki67对不同分子分型乳腺癌有一定的预测预后价值[12]。

ER及PR在乳腺癌中的作用机制已被深入研究，基于抗雌激素的治疗手段已经广泛应用于临床，作为类固醇受体超家族的另一个重要成员AR也高度表达于乳腺癌组织中，但其在乳腺癌发生发展中的作用机制尚未完全阐明，还在不断研究当中。Barton等[13]研究发现AR在TNBC中的阳性表达率为12%～55%，Kono等研究显示AR在TNBC中的阳性表达率为10%～35%[14]。我们对94例三阴性乳腺癌的AR表达情况进行分析，AR阳性率为35.1%(33/94)，与文献报道结果基本一致，表明AR在三阴性乳腺癌中有着相对较高的阳性表达率。Barton等[13]的研究还发现AR阳性表达的TNBC对化疗敏感性比较低，其原因可能是与AR阴性表达者相比较，AR阳性表达的TNBC的Ki67表达指数比较低，这与我们此次研究发现的AR阴性表达与Ki67高增殖表达(Ki67≥20%)显著相关(P<0.05)的结论相一致。另据文献报道，AR阳性表达是预测TNBC无病生存率和总生存率的不良预后指标[15]，这与另一篇报道里发现的AR阳性表达的TNBC有着复发延迟的现象以及更好的预后[10]的结论相悖。因此我们大胆猜测，在三阴性乳腺癌中一定还存在与AR相关联的其他信号通路，影响着AR阳性表达的三阴性乳腺癌的进展与预后，而这其中相关联的信号通路会不会与BRCA1相关呢？

Zhang等在对149例非转移性乳腺癌患者样本的组织芯片研究发现BRCA1过表达可通过激活SIRT1显著抑制乳腺癌细胞中AR的表达，最终他们的研究结果表明BRCA1通过SIRT1介导的途径抑制AR刺激的乳腺癌细胞增殖[2]。Luo等[16]首次探讨了AR、PARP1和BRCA1在TNBC中的相关性。他们发现BRCA1过表达后，AR和PARP1在mRNA和蛋白水平上表达降低。AR正向调控PARP1，而PARP1也上调AR在体外的表达。此外他们还通过使用TNBC患者样本的组织芯片证实了在TNBC患者中BRCA1的表达与AR和PARP1呈负相关，而我们此次研究未发现BRCA1与AR表达有明显相关性(P>0.05)，这些分歧可能与样本来源、样本数量及统计方法等存在差异有关，Luo等[16]的研究结果表明比卡鲁胺和PARP抑制剂联合使用可能是治疗TNBC的一种潜在策略，值得进一步评估。在另一篇大宗数据的meta分析中，笔者通过研究总结出在三阴性乳腺癌(TNBC)中，表皮生长因子受体(EGFR)的表达水平和BRCA1突变患病率的表达要高于非三阴性乳腺癌(non-TNBC)。相反，雄激素受体(AR)在TNBC的表达水平比非TNBC中要低。AR和EGFR的不同表达以及BRCA1突变的发生率提示AR、EGFR和BRCA1可能是TNBC靶向治疗和预后的独特的生物标志物[17]。

BRCA1、AR在三阴性乳腺癌发生发展中与多条肿瘤相关信号通路的作用机制尚未完全阐明，同时关于两者之间的相互关系及作用也尚未明确，但是BRCA1和AR在三阴性乳腺癌中的高阳性表达率及它们之间的交互作用为学者寻找三阴性乳腺癌的新治疗方案和潜在治疗靶点提供了理论支持，非常值得进一步深入探究。