CaCl2作用下核诱导形成乳清蛋白纤维聚合物特性研究

2021-10-13徐红华郭芮池谢明明马彩虹刘玉琪

农业机械学报 2021年9期

徐红华郭芮池谢明明马彩虹陈颖刘玉琪

(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

0 引言

乳清作为生产奶酪的副产品长久以来被人们充分利用[1-2]。乳清蛋白在改善食品的性质、提高食品质量等方面具有重要作用[3-4]。乳清蛋白在低pH值、低离子强度、长时间高温加热条件下能够形成纳米纤维聚合物[5-6]。这种纤维聚合物是一种长的、半柔性的淀粉状纤维，具有常规聚合物不具备的优良特性，在起泡性、乳化性等方面性质良好[7-8]。乳清蛋白纤维聚合物可以通过自发和核诱导2种方式自组装形成，但是，蛋白质纤维聚合物的形成受离子强度的影响很大，一般盐的加入会改变其组装路径进而导致形成能力丧失[9-10]，这也是其应用受到限制的主要原因。核的形成主要来自乳清蛋白组装初期形成的具有晶体结构的低聚物(均相核)和最终的成熟纤维(二次核)[11-12]。针对乳清蛋白纤维聚合物只能在低离子条件下形成的缺陷[13-14]，本文研究乳清蛋白组装聚合物界面性质，通过改变CaCl2浓度分析核诱导方式下形成的纤维聚合物能够耐受的离子强度，通过分析功能性质改变所产生的纤维组装结构变化，探究CaCl2对核形成(第1阶段)、核诱导(第2阶段)、纤维聚合物(第3阶段)界面性质(乳化性、起泡性)的变化，同时研究CaCl2对乳清蛋白聚合量动力学、纤维生成量的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

乳清浓缩蛋白WPC-80，美国HILMAR公司;CaCl2，纯度99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;硫黄素T，Sigma公司;其他化学试剂均为分析纯。

1.2 样品制备

1.2.1均相核与二次核制备

乳清浓缩蛋白(WPC)：参照文献[15-16],取5.00 g乳清浓缩蛋白粉(WPC-80)溶于去离子水中，使用6 mol/L和1 mol/L HCl调pH值至2.0并用pH值2.0的水(事先用6 mol/L HCl调节pH值)定容至100 mL，16 000g离心20 min(4℃)，取中层清液，凯氏定氮测定蛋白质含量，用pH值2.0的去离子水稀释至质量分数3.0%，4℃冰箱保存。

均相核：参照文献[17-18]，上述pH值2.0、质量分数3.0%的WPC在90℃水浴加热2 h，4℃冰箱保存。

二次核：参照文献[19]，上述pH值2.0、质量分数3.0%的WPC在90℃水浴加热10 h，4℃冰箱保存。

1.2.2纳米纤维制备

自发：质量分数3.0%的WPC(pH值2.0)于90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。

均相核诱导：将上述均相核与质量分数3.0%的WPC(pH值2.0)以体积比1∶3混合均匀，90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。

二次核诱导：将上述二次核与质量分数3.0%的WPC(pH值2.0)以体积比1∶3混合均匀，90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。

空白样品的制备：为了消除核自身与WPC原料结构的差异，将1.2.1节形成的WPC、均相核、二次核分别与pH值2.0的水以体积比1∶3混合均匀，90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。后续测定的各项指标均减去空白样的相应值。

1.3 CaCl2对核形成的影响

为了探究CaCl2对核形成的影响，在乳清蛋白原料中加入不同离子强度的CaCl2制备核，并进行核诱导，判断在CaCl2作用下形成的核是否具有诱导形成正常纤维的能力。

CaCl2对均相核形成的影响:取pH值2.0、质量分数3.0%的WPC 28 mL添加2 mL浓度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2使溶液中CaCl2浓度分别为0、20、50 mmol/L，蛋白最终质量分数为2.86%，混合均匀后90℃水浴加热2 h，4℃冰箱保存。

CaCl2对二次核形成的影响: 取pH值2.0、质量分数3.0% 的WPC 28 mL添加2 mL浓度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2，使溶液中CaCl2浓度分别为0、20、50 mmol/L，蛋白最终质量分数为2.86%，混合均匀后90℃水浴加热10 h，4℃冰箱保存。

之后将上述在CaCl2作用下形成的均相核、二次核与质量分数3.0%的WPC(pH值2.0)以体积比1∶3混合均匀，90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。

空白样品的制备：将上述在CaCl2作用下形成的均相核、二次核与pH值2.0去离子水以体积比1∶3混合均匀，以保证核浓度相同，90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。

1.4 CaCl2对核诱导能力的影响

为了探究CaCl2对核诱导的影响，核形成之后加入不同离子强度的CaCl2，通过核诱导制备纤维，与不加CaCl2的自发相比判断CaCl2对核诱导的影响。

CaCl2对均相核诱导能力的影响：pH值2.0、质量分数3.0%的 WPC均相核与质量分数3.0% WPC以体积比1∶3混合均匀，取28 mL上述蛋白样品添加2 mL CaCl2使溶液中CaCl2浓度分别为0、20、50 mmol/L，蛋白最终质量分数均为2.86%，90℃水浴加热2 h，取样并于4℃冰箱保存。

CaCl2对二次核诱导能力的影响: pH值2.0、质量分数3.0%的WPC均相核、二次核与质量分数3.0%的WPC以体积比1∶3混合均匀，取28 mL上述蛋白样品添加2 mL浓度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2使溶液中CaCl2浓度分别为0、20、50 mmol/L，蛋白最终质量分数均为2.86%，90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。

空白样品的制备：WPC、均相核、二次核分别与去离子水(pH值 2.0)以体积比1∶3混合，取28 mL混合样品添加2 mL浓度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2使溶液中CaCl2浓度分别为0、20、50 mmol/L，90℃水浴加热10 h，取样并于4℃冰箱保存。

1.5 界面性质

为探究在不同阶段添加CaCl2对纳米纤维聚合物功能性质的影响，测定了在CaCl2作用下形成的核诱导WPC、在诱导过程中添加CaCl2、在纤维成熟后添加CaCl2的自发、均相核诱导、二次核诱导的起泡性与乳化性，样品均为热处理10 h，CaCl2浓度为0、20、50 mmol/L。

1.5.1起泡性

参照文献[20-21]并加以改进，用pH值7.0的去离子水将蛋白质量分数稀释至0.15%，室温(20℃)下均质1 min(10 000 r/min)后测定泡沫的体积，并记录静置至泡沫消泡至原体积一半的时间。通过相对溢出量和静止后稳定的泡沫体积比测定样品的起泡能力和泡沫稳定性指数，具体计算方法为

FC=V0/Vi×100%

(1)

FS=t1/2

(2)

式中FC——起泡能力,%

FS——泡沫稳定性指数，min

V0——起泡0 h时的泡沫体积

Vi——起泡前最初液体的体积

t1/2——消泡至V0/2的时间，min

FCWPC=FC-FC0

(3)

FSWPC=t-t0

(4)

式中FCWPC——被诱导WPC的起泡能力,%

FC0——对应空白样品的起泡能力,%

FSWPC——被诱导WPC的泡沫稳定性指数，min

t——样品的泡沫稳定性指数，min

t0——对应空白样品的泡沫稳定性指数，min

1.5.2乳化性

参照文献[22]的方法并加以改进，用pH值2.0的去离子水稀释样品至质量分数1.0%，取30 mL的样品加入10 mL大豆油，室温下用高速匀浆机20 000 r/min下均质3 min，立即取底部乳状液30 μL加入5 mL质量分数0.1%的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在500 nm处测定吸光度，以质量分数0.1%的SDS为空白调零，乳化活性指数和乳化稳定性指数计算公式为

EAI=2×2.303/[C(1-φ)×104]A500×100

(5)

(6)

式中EAI——乳化活性指数，m2/g

ESI——乳化稳定性指数，%

C——蛋白质质量浓度，g/mL

A500——溶液在500 nm下的吸光度

φ——大豆油占乳化液的体积分数，取25%

At——乳化液静置20 min时的吸光度

A0——乳化液静置0 min时的吸光度

EAIWPC=EAI-EAI0

(7)

ESIWPC=ESI-ESI0

(8)

式中EAIWPC——被诱导WPC的乳化活性指数，m2/g

EAI0——对应空白样品的乳化活性指数，m2/g

ESIWPC——被诱导WPC的乳化稳定性指数，%

ESI0——对应空白样品的乳化稳定性指数，%

1.6 Th T荧光强度

参照文献[23]的方法并加以改进，取0.80 g甲硫磺素T(Th T)溶于0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸缓冲液(pH值7.0)，并定容至1 000 mL。用水系0.22 μm滤膜过滤，所得滤液即为Th T储备液。测定时使用Th T工作液，即储备液含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸缓冲液(pH值7.0)稀释50倍。储备液与工作液均存放在冰箱4℃避光棕色瓶内。取800 μL样品加入10 mL的Th T工作液中，旋涡振荡1 min后，于荧光分光光度计下比色。设定参数为：激发波长为460 nm，发射波长为490 nm，狭缝宽度分别为5 nm和10 nm，测定不同加热时间下样品的荧光强度公式为

ThTWPC=ThT-ThT0

(9)

式中ThTWPC——被诱导的WPC的Th T荧光强度

ThT——样品的Th T荧光强度

ThT0——对应空白样品的Th T荧光强度

被诱导的WPC每小时荧光强度变化量为诱导t+1 h的荧光强度减去诱导t的荧光强度。

1.7 蛋白聚合率

取20 mL样液于50 mL离心管中，15 000g、4℃离心30 min，取上层清液，利用凯氏定氮法测定蛋白含量，计算公式为

C′=Ct/C0×100%

(10)

式中C′——蛋白聚合率，%

C0——初始样品蛋白质质量浓度，mg/mL

Ct——t时未聚合蛋白质质量浓度，mg/mL

核诱导过程中核自身也会发生变化，本试验中为去除核自身的影响，研究被诱导的WPC蛋白聚合率的变化，因此需要减去空白样品的蛋白聚合率，公式为

C′WPC=C′-C′0

(11)

式中C′WPC——被诱导的WPC蛋白聚合率

C′0——对应空白样品的蛋白聚合率

1.8 蛋白质聚合速率

利用1.7节中的数据结果和非线性回归速率公式计算自发、均相核诱导、二次核诱导在形成纤维过程中加入不同浓度CaCl2的动力学参数公式为

-df/dt=knCn

(12)

式中 df/dt——每小时荧光强度变化量，h-1

n取1。在一定的加热时间t后，蛋白形成聚合物通过离心沉淀聚合物，上清液中蛋白质量浓度由C0下降至Ct(g/L)，活化能满足公式

(13)

Ea=-RTlnk+C

(14)

(15)

式中k——反应速率常数(蛋白质聚合速率)

Ea——反应的活化能

R——气体常数，取8.314 J/(mol·K)

T——热力学温度

1.9 数据统计分析

所有试验均重复3次。采用SPSS 16.0软件进行方差分析(ANOVA)，检验差异显著性(P<0.05)，结果均用平均值±标准差表示，使用Excel 2010软件制图。

2 结果与讨论

2.1 乳化性

采用核诱导方式制备乳清蛋白纳米纤维，整个过程分为3个阶段：第1阶段核形成时期；第2阶段核诱导时期；第3阶段纤维聚合物已形成时期[24-25]。CaCl2在不同阶段混入对纤维聚合物的形成可能有不同影响，通过乳化性能的差异推断可能产生的结构差异。从图1(图中不同大写字母表示组间差异显著，不同小写字母表示组内差异显著，下同)可以看出，未添加CaCl2时核诱导的乳化活性高于自发，其中二次核诱导高于均相核诱导。添加CaCl2时，乳清蛋白通过自发方式形成纤维聚合物的乳化活性无明显变化，对于核诱导方式而言，核形成时期(第1阶段)添加CaCl2会降低其乳化活性，但在核诱导期以及纤维形成之后(第2、3阶段)则无影响，且乳化活性优于自发方式。

对其乳化稳定性而言，未添加CaCl2时核诱导的乳化稳定性高于自发，其中二次核诱导高于均相核诱导。在核形成时期(第1阶段)添加CaCl2，其乳化稳定性降低程度高于自发方式；与第1阶段不同，核诱导阶段(第2阶段)添加CaCl2，核诱导方式比自发方式表现出更好的乳化稳定性能，二次核诱导更为突出，CaCl2浓度为50 mmol/L时，均相核诱导、二次核诱导乳清蛋白形成的纤维聚合物较自发方式样品乳化稳定性指数分别降低了30.92%、34.09%；对于纤维已经形成的第3阶段添加CaCl2的样品乳化稳定性无明显变化。

2.2 起泡性

起泡能力如图2所示，未添加CaCl2时，核诱导的起泡能力高于自发，其中二次核诱导高于均相核诱导。在核形成时期(第1阶段)添加CaCl2时，自发样品的起泡能力无明显变化，核诱导样品的起泡能力明显低于自发样品；其中二次核诱导样品较均相核诱导样品的起泡能力相比略低，且起泡能力随CaCl2浓度变化较小。第2、3阶段添加CaCl2样品的起泡能力分别与对照样相比无明显变化。

泡沫稳定性如图2所示，第1阶段添加CaCl2时破坏了纤维核的形成，使其不能正常形成纤维聚合结构，表现出对CaCl2的耐受性差，导致样品的泡沫稳定性均低于自发方式样品，且随CaCl2浓度的增加而降低；第2阶段添加CaCl2时，纤维核已经形成，诱导乳清蛋白形成纤维聚合物的过程中对CaCl2耐受性强于自发样品，导致样品的泡沫稳定性比自发样品高，且随CaCl2浓度的增加而增加，在添加50 mmol/L CaCl2时，均相核诱导、二次核诱导泡沫稳定性指数分别降低了68.18%、78.59%。第3阶段添加CaCl2时纤维已经形成，CaCl2对纤维无影响，导致样品的泡沫稳定性变化不大。

2.3 Th T荧光分析

2.3.1核形成

通过测定样品的Th T荧光强度，判断在CaCl2作用下形成的核是否具有诱导形成正常纤维的能力[26-27]。硫黄素(Th T)是一种荧光染料，可特异性与纤维β-折叠结构相结合，可侧面反映纤维的数量[28-29]。由图3可知，CaCl2对核的形成有影响，CaCl2对均相核与二次核的形成影响有所不同，2种核丧失诱导能力的程度不同。

在低CaCl2浓度下，自发的荧光强度大于核诱导，且均相核大于二次核；证明在该条件下核的形成受到破坏，丧失诱导能力。在高CaCl2浓度下，自发的荧光强度大于核诱导，且均相核大于二次核； CaCl2浓度越高破坏能力越强。

2.3.2核诱导过程纤维量

如图4所示，未加CaCl2时，自发的荧光强度低于2种核诱导，且二次核诱导高于均相核诱导，2种核诱导可增加纤维量。2种核在20 mmol/L的CaCl2浓度下，核诱导样品的荧光强度高于自发样品，均相核、二次核仍具有诱导能力，且二次核诱导高于均相核诱导。在50 mmol/L的CaCl2浓度下时，自发、均相核诱导、二次核样品较对照组样品的荧光强度均减少，分别减少了23.14%、28.43%、26.91%，说明在诱导过程中CaCl2降低核诱导能力，破坏纤维结构，但荧光强度上依旧保持着核诱导高于自发、二次核高于均相核的规律。

为探究核诱导在添加不同浓度CaCl2后核诱导能力的差异，用添加CaCl2的二次核样品的Th T荧光强度与不加CaCl2的样品作差，ThT荧光强度下降27.55%。添加CaCl2的样品Th T荧光强度减小，均相核诱导与二次核诱导在低CaCl2浓度下其Th T荧光强度依旧高于自发，说明依然具有诱导能力；高CaCl2浓度下其Th T荧光强度下降，诱导能力丧失。此结果表明核诱导过程中加入盐离子会破坏纤维结构的形成。

综上，纤维核通过自发方式形成时对CaCl2的耐受能力差，这也说明盐离子对乳清蛋白自组装形成纤维聚合物的破坏主要是影响核的形成；相反，一旦纤维核已经形成，相比自发方式，核诱导方式更能够在一定的盐离子条件下诱导乳清蛋白形成纤维聚合物。

2.4 蛋白质聚合能力

2.4.1蛋白质聚合率

如图5所示，延长加热时间，不同样品的未聚合量均呈现下降趋势，3种样品随CaCl2浓度增加，未聚合量逐渐降低，表明延长热处理时间和提高CaCl2浓度会促进蛋白质之间聚合形成大分子聚合物。纤维形成过程主要分为3个阶段，滞后期(0～2 h)、指数增长期(2～5 h)、成熟期(5～10 h)。与自发手段不同，核诱导的聚合量在滞后期增长较快，而自发在指数增长期同样增长迅速。在滞后期CaCl2对聚合速率的影响尤为明显，加入CaCl2会显著提高样品的聚合速率，且随CaCl2浓度升高提高幅度越大。

2.4.2蛋白质聚合速率

自发、均相核诱导、二次核诱导添加CaCl2后热处理形成纤维聚合物的聚合动力学参数存在一定差异(见表1)。未添加CaCl2时，均相核与二次核诱导的聚合速率高于自发，分别是自发的1.44与1.61倍，二次核诱导的聚合速率最大，核诱导的活化能低于自发，说明核诱导更容易达到活化状态，更易聚合形成纤维。添加CaCl2可明显提高自发和核诱导2种纤维聚合方式的聚合速率，降低活化能，改变幅度随离子浓度的增加而增大。在CaCl2浓度为50 mmol/L时，自发、均相核诱导、二次核诱导其聚合速率较其对照样(未加CaCl2样品)分别提高了41.98%、45.75%、44.49%。通过聚合量动力学参数可知，CaCl2的加入可促进聚合反应，加快聚合速率，降低活化能。文献[30-31]研究同样也指出向蛋白中添加纤维核就是引入了有序的区域，这导致了酸水解形成的肽段可以直接吸附到均相核上，从而导致滞后期缩短，加快了纤维形成速率。由于核诱导形成纤维的聚合速率高于自发方式，加入CaCl2产生的这种聚合动力学的变化可能对核诱导聚合形成纤维的影响更小。

表1 自发、均相核诱导、二次核诱导添加CaCl2后热处理聚合动力学参数Tab.1 Polymerization kinetic parameters for spontaneous, homogeneous nucleation-induction and secondary nucleation-induction addition of CaCl2 after heat treatment