基于多波长切换HPLC同时测定荆芥-防风药对9种化学成分及指纹图谱研究

管娜，拜年，刘冰，毛小文

1.新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000

荆芥-防风是中医临床治疗风邪所致疾病的常见药对，二者常以1∶1 配伍相须为用，并走于上，发散风寒、祛风胜湿之力增强，常用于外感风寒、发热恶寒、头痛身痛、风疹瘙痒等。《本草求真》曰：“荆芥……不似防风气不轻扬，驱风之必入人骨肉也，是以宣散风邪，用以防风之必兼用荆芥者，以其能入肌肤宣散故耳。”荆芥-防风药对可单独成方，如荆防散；也常作为君药组成复方，如消风散、驱风一字散、防风通圣丸等。

药理研究表明，荆芥和防风具有相似的药理作用，两者均可抗炎、抗过敏、抗病毒、解热、镇痛、镇静、抗菌、止血、抗惊厥、增强免疫等[1-3]。荆芥、防风挥发油的抗炎作用均优于单味药，表明该药对在抗炎效应上表现出协同作用[4]。李晓如等[5]研究发现，荆芥、防风配伍后其挥发油成分组成及相对含量均发生变化，并产生新物质。

目前，对于该药对单独成方或作为君药的制剂，其质量控制均以荆芥、防风成分为主要指标，但存在质量控制成分单一，成分代表性不强，达不到整体控制效果等问题。本试验基于多波长切换HPLC 技术同时测定荆芥-防风药对中9 种化学成分，并建立其指纹图谱，为该药对相关制剂的综合质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200 高效液相色谱仪（包括G1329A 自动进样器、G1322A 脱气机、G1311A 四元泵、Chemstation 色谱工作站、G1315B 可变波长检测器）。对照品木犀草苷（批号CHB201227，纯度≥98%）、橙皮苷（批号CHB201220，纯度≥98%）、木犀草素（批号CHB201228，纯度≥98%）、芹菜素（批号CHB201124，纯度≥98%）、升麻素苷（批号CHB201107，纯度≥98%）、升麻素（批号CHB201106，纯度≥98%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号CHB201227，纯度≥98%）、印枳树皮苷（批号CHB200719，纯度≥98%）、亥茅酚苷（批号CHB201205，纯度≥98%），成都克洛玛生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸，色谱纯，天津大茂化学试剂厂。20 批荆芥、防风饮片，购自新疆康达堂医药有限公司，经甘肃省人民医院药剂科郑修丽副主任中药师鉴定，荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifoliaBriq.的干燥地上部分，防风为伞形科植物防风Saposhnibopia divaricata（Turcz.）Schischk 的干燥根。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液

分别精密称取对照品木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、印枳树皮苷、亥茅酚苷适量，混合，加甲醇，摇匀，制成浓度分别为木犀草苷15.1 μg/mL、橙皮苷181.2 μg/mL、木犀草素30.26 μg/mL、芹菜素28.74 μg/mL、升麻素苷173.4 μg/mL、升麻素114.08 μg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷165.29 μg/mL、印枳树皮苷158.16 μg/mL、亥茅酚苷167.84 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取荆芥、防风粉末各1g，精密称定，混合置于50 mL 具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声（功率500 W，频率40 kHz）提取30 min，取出，放冷至室温，过滤，加甲醇适量，洗涤2 次，合并滤液和洗液，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

采用Agilent SB C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇（1∶1，A）-0.03%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0→19 min，12%→13%A；19→25 min，13%→14%A；25→40 min，14%→25%A；40→53 min，25%→45%A；53→70 min，45%→60%A；70→90 min，60%→80%A），多波长切换检测（0～61 min 为283 nm，检测木犀草苷、木犀草素、芹菜素、橙皮苷；61～90 min 为254 nm，检测升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、印枳树皮苷、亥茅酚苷），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。供试品溶液色谱中与各对照品对应的色谱峰理论塔板数均大于3000，9种成分所对应色谱峰的分离度均大于1.5。

2.3.2 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液1、2、4、6、8、10、20μL，注入色谱仪，按“2.2”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以对照品进样量（μg）对峰面积进行线性回归[6]，结果见表1。9种成分在各自线性范围内均有良好的线性关系，相关系数为0.9997～1.000 0。

表1 9 种成分线性关系考察结果

2.3.3 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μL，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定并记录峰面积，结果木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、印枳树皮苷、亥茅酚苷峰面积RSD 分别为0.32%、0.76%、0.75%、1.89%、1.66%、2.24%、1.74%、2.08%、1.56%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取样品（JF1），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于室温放置0、2、4、6、12、24、48h，按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算得到木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、印枳树皮苷、亥茅酚苷在48h 内峰面积RSD分别为1.73%、0.31%、1.53%、2.06%、2.67%、3.16%、2.83%、2.15%、3.14%，表明供试品溶液在48h内稳定。

2.3.5 重复性试验

取同一批样品（JF1）6份，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析，计算得到木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、印枳树皮苷、亥茅酚苷含量RSD分别为1.25%、1.38%、1.13%、1.37%、1.23%、2.54%、3.14%、2.24%、2.66%，表明方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取已测含量的同一批样品（JF1）9份，每3份为一组，按低、中、高3个水平精密加入混合对照品溶液适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、印枳树皮苷、亥茅酚苷的平均加样回收率分别为100.58%、97.05%、101.55%、98.13%、102.64%、99.26%、97.54%、102.52%、98.71%，RSD分别为1.38%、2.35%、1.54%、2.58%、3.02%、1.96%、3.27%、2.04%、0.86%。9种成分的回收率均符合要求。

2.4 样品含量测定

取20批样品（JF1～JF20），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算9 种成分的含量。混合对照品及供试品HPLC图谱见图1，测定结果见表2。

表2 20批荆芥-防风药对样品中9种成分含量测定结果（mg/g）

图1 荆芥-防风药对中9 种成分HPLC 图谱

荆芥-防风药对中9种成分含量分别为：木犀草苷0.560 5～1.291 6 mg/g，橙皮苷0.926 2～3.114 9 mg/g，木犀草素0.1286～1.4629mg/g，芹菜素0.1305～0.4472mg/g，升麻素苷0.6406～2.100 8mg/g，升麻素0.1811～0.8012mg/g，5-O-甲基维斯阿米醇苷0.3511～2.324 3 mg/g，印枳树皮苷0.019 6～0.162 2 mg/g，亥茅酚苷0.3373～0.5374 mg/g。

2.5 指纹图谱建立及相似度评价

取20批样品（JF1～JF20），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样记录色谱图，将色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版），以JF1色谱图为参照，采用平均数法、时间窗宽度0.1生成特征图谱（R），进行多点校正和自动匹配，计算20批荆芥-防风药对指纹图谱的相似度。20 批样品HPLC指纹图谱见图2特征图谱（R）见图3，相似度结果见表3。

表3 20 批荆芥-防风药对HPLC 指纹图谱相似度

图2 20批荆芥-防风药对HPLC指纹图谱

图3 荆芥-防风药对HPLC特征图谱

20批荆芥-防风药对与特征图谱的相似度为0.914～0.972，均大于0.9，表明不同批次样品的化学成分具有较好的一致性。指纹图谱共检测出24个共有峰，通过对照品对照结合紫外吸收图，指认了木犀草苷（4号峰）、橙皮苷（7号峰）、木犀草素（10号峰）、芹菜素（11号峰）、升麻素苷（12号峰）、升麻素（13号峰）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（14号峰）、印枳树皮苷（15号峰）、亥茅酚苷（21号峰）9种成分的色谱峰。

3 讨论

本试验对流动相种类（甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-甲醇-水、乙腈-甲醇-甲酸水）、甲酸比例（0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.1%）、色谱柱柱温（25、30、35、40 ℃）、流速（0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min）及进样量（5、10、15、20 μL）进行了优化，综合考虑基线情况、色谱峰峰形、分离度、分析时间等，最终选择以乙腈-甲醇（1∶1）-0.03%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 m L/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

多波长检测结果实质是多个波长下色谱峰吸收的叠加，通过优选色谱峰的最大吸收波长，能够获取更多共有峰信息，从而更为准确、直接地反映样品的峰信息，但进行波长切换时可能出现基线波动。本试验首先以全波长扫描所得吸收峰作为检测波长，结合文献[7-8]报道，确定木犀草苷、木犀草素、芹菜素、橙皮苷检测波长在283 nm 附近，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、印枳树皮苷、亥茅酚苷检测波长在254 nm 附近，并于61 min 时进行波长切换，使更多色谱峰得到了较好的分离与分析，且未引起明显的基线波动。

对荆芥-防风药对进行较好的质量控制，是相关制剂质量控制的关键。本试验通过多指标成分测定及指纹图谱，建立了荆芥-防风药对的质量控制方法。在测定成分的选择方面，尽可能选取荆芥、防风的代表性有效成分。研究表明，黄酮类成分是荆芥抗肿瘤[9]、抗氧化及抗炎[10]的主要有效成分，木犀草苷、木犀草素、橙皮苷、芹菜素均为荆芥黄酮的主要成分[8]。防风的色原酮类和香豆素类成分是其主要有效成分[11]。升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷等是防风中色原酮类代表性成分，印枳树皮苷是防风中香豆素类代表性成分，具有抗氧化、抗炎、解热镇痛及抗血小板聚集等作用[12-13]，与防风的功效相符。此外，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷是2020 年版《中华人民共和国药典》防风质量控制的指标成分[14]。