基于网络药理学与数据挖掘探讨中药调节细胞焦亡用药规律

但文超，刘金垒，何庆勇，张辉，李安琪

1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029

细胞焦亡是一种不同于细胞坏死、细胞凋亡的促炎性细胞程序性死亡形式，具有极为显著的免疫炎症特点，又称为细胞炎性坏死。它由炎性小体启动，促炎性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）介导[1]，此类蛋白酶属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶集团，其中介入细胞焦亡的蛋白酶包括Caspase-1、3、4、5、11。这些蛋白可对Gasdermin D 蛋白的N 端特异性切割，进而激活其成孔活性，致使质膜破裂，伴随着促炎因子和细胞内容物的释放，其中包括白细胞介素（IL）-1β、IL-18 和内源性危险性信号蛋白HMGB-1[2-3]。与此同时，炎性小体吸引其他炎性细胞并增剧炎症反应，出现了介于坏死和凋亡过程之间的细胞死亡[4]。目前已探明的细胞焦亡发生途径主要有2 种，即由Caspase-1介导的经典途径及由Caspase-4、5、11 介导的非经典途径。此外，Caspase-3 介导的Gasdermin E（GSDME）裂解亦能促进细胞焦亡[5-6]。细胞焦亡在多种疾病的发生发展进程中均有重要作用，如心肌再灌注损伤、动脉粥样硬化、梗阻性肾病炎性损伤、神经系统疾病、慢性肝病、阿尔茨海默病、癌症等[7-8]。因此，细胞焦亡的机制与研发细胞焦亡的干预制剂已成为近年的研究热点。已有研究表明中药对细胞焦亡具有干预作用：化瘀解毒中药能下调炎症小体NLRP3 的表达，抑制Caspase-1 的表达与IL-1β 等介导的炎症反应，以阻碍细胞焦亡进展[9]；灭幽汤能使胃组织中NLRP3和Caspase-1 表达下调，从而抑制细胞焦亡，改善胃黏膜炎症，发挥对幽门螺杆菌相关胃炎的治疗作用[10]；参苏饮能抑制Caspase-1 经典途径介导的细胞焦亡，从而减轻“肺气虚外感”大鼠的炎症反应[11]。

中药复方的干预机制具有靶点多位、层次丰富、疗效稳固、安全性高等特点，中药系统网络药理学研究方法能够将中药、成分、靶点等层次的信息进行整合筛选，从而清晰呈现调节细胞焦亡相关的药物、成分、靶点之间的关系，为研究中医药对细胞焦亡的调节机制提供有效途径。本研究采取网络药理学方法，以细胞焦亡相关靶点作为切入点，匹配出相应的配体化合物及中药，初步探索靶点、化合物、中药之间的复杂联系，探讨中药干预细胞焦亡的物质基础及一般规律，为后续调控细胞焦亡的中医理论探讨、治疗策略、新药研发及中西医结合临床提供思路和依据。

1 资料与方法

1.1 细胞焦亡相关作用靶点收集

登录GeneCards（http://www.genecards.org）[12]、OMIM（https://omim.org）[13]、TTD（https://bidd.nus.edu.sg）[14]、DrugBank（https://www.drugbank.ca）[15]、DisGeNET（www.disgenet.org）[16]数据平台，以“pyroptosis”为关键词进行检索，获得与细胞焦亡作用机理相关的靶点，并采用蛋白数据库 UniProt（https://www.uniprot.org/）[17]匹配各靶点全称。

1.2 候选化合物筛选及化合物-靶点网络构建

运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com）[18]收集可作用于细胞焦亡相关靶点的化合物成分。根据ADME 参数和Lipinski 规则[19]对候选化合物进行遴选，具体标准为：口服生物利用度（OB）≥30%，半衰期（HL）＞4，类药性[20]（DL）≥0.18，拓扑极性表面积[21]（TPSA）＜140，可旋转键数[22]（RBN）≤10，分子量（MW）≤500 Da。考虑TCMSP 所提供成分信息参数包含计算机预测的结果，部分数据可能与实际应用不符，故初步筛选后，逐一查看被删除的成分，补充相关活性成分，将得到的化合物作为候选化合物。将候选化合物、靶点导入Cytoscape3.7.2 软件[23]，构建靶点-化合物网络，并对网络节点的拓扑学属性值进行分析。

1.3 中药获取及靶点-化合物-中药网络构建

通过 TCMSP、化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn）收集包含候选化合物的中药，并构建候选化合物-中药网络，结合化合物-靶点网络，利用Cytoscape3.7.2 软件构建靶点-化合物-中药网络，通过Cytoscape3.7.2的NetworkAnalyzer 模块功能计算网络中各节点的拓扑学参数以找出关键节点，初步评判中药及化合物干预细胞焦亡功效强度。

1.4 药物性味归经整理及频数?分析

参照2015年版《中华人民共和国药典》[24]、《中药学》[25]、《中国临床药物大辞典》[26]对“1.3”项下中药匹配性味归经信息，并进行频数分析。若上述文献均无法查到相关信息，则将该药予以删除。

1.5 靶点-候选化合物分子对接

为进一步判断靶点-化合物-中药网络中核心靶点及核心成分作用关系的可信度，并探寻新的药物靶点组合，选取该网络中度值排名前5 位的靶点作为受体，进行分子对接。尽管CASP1度值仅为2，但与细胞焦亡关系较为紧密，故亦将其作为受体进行对接。

登录RCSB数据库（http://www.rcsb.org/pdb/），选取5种蛋白质的晶体结构，保存为.pdb格式。通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载候选化合物3D结构，保存为SDF 文件，通过Open Babel转换为.pdb格式文件。运用AutoDock Tools1.5.6软件剔除配体中的水分子，分散配体与受体，增添非极性氢键，标定Gasteiger 电荷，分别存储为.pdbqt 格式文件。对筛选出的潜在核心成分配体进行能量最小化处理，赋予配体原子类型、计算电荷，保存为.pdbqt格式。运用AutoDock Vina 1.1.2软件计算对接得分，评估靶点与配体之间的匹配度及对接活性，对接得分＜-4.25可认为配体与靶点之间具有结合活性，对接得分＜-5.0表明结合活性较佳，对接得分＜-7.0表明两者之间有强烈的对接活性[27]。

2 结果

2.1 细胞焦亡相关靶点

通过GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET、DrugBank 数据库分别获得83、14、0、5、0个与细胞焦亡相关靶点，去除重复值并经UniProt 数据库规范，最终获得细胞焦亡相关靶点81个，其中通过TCMSP匹配到小分子化合物的靶点有16个，故将这16个靶点定义为潜在靶点，见表1。

表1 细胞焦亡潜在靶点基本信息

2.2 候选化合物及靶点-化合物网络

通过TCMSP数据库，以“可关联到潜在靶点”为条件，筛选得到113个化合物，根据ADME参数和Lipinski 规则筛选得到90个候选化合物。将潜在靶点与候选化合物构建靶点-化合物网络，见图1。该网络由106个节点和184条边组成。图中节点度值为所连接边的数量，度值越大提示节点枢纽性越强，在整个网络中调控作用越大。统计结果显示，度值前6位的化合物分别为金雀异黄酮（genistein）、白藜芦醇（resveratrol）、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin-3-gallate）、槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolicacid）、雌二醇（17-beta-estradiol），分别对应8、8、6、5、5、5个靶点，这些化合物可干预多个细胞焦亡相关靶点蛋白从而具有较强活性。度值前6位的靶点为CASP3、BCL2、IL1B、AKT1、STAT3、EGFR。

图1 细胞焦亡靶点-化合物网络

2.3 中药匹配及靶点-化合物-中药网络

90个候选化合物匹配得到462味中药，根据化合物与中药的关系构建化合物-中药网络，该网络包含552个节点、2048条边。其中度值居前9位的中药为麻黄、葛花、沙棘、菊花、连翘、紫菀、紫苏、红花、芫荽，分别含化合物15、15、14、14、13、13、13、13、13 个。通过候选化合物的桥接作用收集各中药的靶点，结果显示虎杖、桑白皮、山豆根、鸡血藤、月季花、葛花均可作用10 个靶点，推测这6 种中药对细胞焦亡具有较强的调节作用，可为中西医结合临床或试验的中药选择提供依据。中药所含化合物及靶点数见图2。网络中化合物度值中位数为4，根据经验判定化合物度值＞8 为潜在核心化合物，共27 个，前5 位分别为β-谷甾醇、棕榈酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素，见表2。选取度值≥5 的中药及与其关联的化合物、靶点构建靶点-化合物-中药网络，见图3。

图2 调节细胞焦亡中药的候选化合物及作用靶点（前15 位）

表2 中药调节细胞焦亡潜在核心化合物（度值＞8）

图3 靶点-化合物-中药网络图（中药度值≥5）

2.4 药物性味归经

运用SPSS24.0软件对收集到的462味中药的性味归经信息进行频数统计分析。调节细胞焦亡的中药药味以苦、甘、辛频率较高，药性寒温并重；归肝经频次最高（229次），归肺经达182次，归脾、胃二经共275次。见表3～表5。

表3 462味调节细胞焦亡中药药味分布

表4 462味调节细胞焦亡中药药性分布

表5 462味调节细胞焦亡中药归经分布

2.5 分子对接结果

将27种潜在核心化合物与6个核心靶点CASP3（PDBID：1NMS）、BCL2（PDBID：4A1U）、IL1B（PDBID：1HIB）、AKT1（PDBID：6SB0）、STAT3（PDBID：6NJS）及CASP1（PDBID：1RWN）进行分子对接，见图4。162组对接结果中，Affinity＜-5的共108组（66.67%），Affinity＜-7者13组（8.02%）。162个组合中，在靶点-化合物网络中的组合有53个，其中对接得分最高的为CASP3-rutin（-8.01kcal/mol），对接得分最低的为BCL2-esculetin（-4.48 kcal/mol），网内53个组合平均对接得分为-5.58kcal/mol，表明所筛选的潜在核心化合物与核心靶点间可能有较好的结合活性。这在一定程度上佐证了靶点-化合物网络中药物靶点相互作用的可靠性。网外新组合有109个，Affinity 前3 位为AKT1-hesperidin（-8.94 kcal/mol）、AKT1-rutin（-8.01kcal/mol）、AKT1-β-sitosterol（-7.56kcal/mol）。网外组合Affinity＜-5kcal/mol的有66个，提示均有良好的对接活性。对接结果可为进一步开展相关中药及成分的实验筛选设计提供数据支撑。

图4 调节细胞焦亡潜在核心化合物与核心靶点分子对接结果热图

综合考虑分子对接的Affinity 值及靶点-化合物-中药网络的度值，选择6个较为理想的组合，将其对接情况以三维及二维分子对接模式图展示。各配体均嵌入靶点的活性口袋中，并通过疏水作用及形成氢键等形式与靶点多个残基发生作用，见图5。

图5 调节细胞焦亡化合物与靶点分子对接模式图

3 讨论

细胞焦亡的发生机制与中医理论有密切关联[9]。中药干预细胞焦亡的研究逐渐受到重视，挖掘细胞焦亡相关中药对临床和新药研发具有重要意义。本研究从细胞焦亡相关靶点切入，筛选出细胞焦亡相关化合物及相应中药，构建靶点-化合物-中药网络，并据此系统预测分析了中药调节细胞焦亡的分子基础和作用规律。

根据筛选结果，度值排名靠前的靶点有CASP3、BCL2、AKT1、IL1B、STAT3、EGFR 等。其中CASP3编码 Caspase-3 蛋白能够诱导 GSDME 裂解为GSDME-N段，其可通过对质膜打孔诱导细胞焦亡[28]。BCL-2 家族蛋白作为关键调节因子，可通过调控线粒体通路，调节Caspase 介导的细胞焦亡[29-30]。活化的Caspase-1 切割proIL-1β（IL-1β 非活性前体）转化为活性的IL-1β，并通过Gasdermin D 形成的胞膜孔释放到细胞外，产生炎症反应，并诱导细胞焦亡[31]，故认为通过调控IL-1B 可干预Caspase-1 介导的细胞焦亡过程中的炎症反应。STAT 3 能促进蛋白质的转录，加强细胞周期进程，拮抗程序性细胞死亡，并具有促进机体对皮肤感染和损伤快速响应的作用[32]。EGFR的抑制剂抑制EGFR 活性，导致Caspase-3 活性呈现浓度依赖性上调[33]，进而诱导细胞焦亡，这表明抑制EGFR 能够诱导细胞焦亡。目前尚无AKT1 相关临床或实验研究报道，其在中药干预细胞焦亡中的作用有待研究。

在靶点-化合物网络中，化合物度值较高的有金雀异黄酮、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、熊果酸、山柰酚等。人类多种恶性肿瘤组织中均存在EGFR 的过度表达，金雀异黄酮可下调EGFR mRNA和EGFR 的表达，以促进肿瘤细胞的程序性死亡[34]。表没食子儿茶素没食子酸酯可上调Caspase-3 的表达、抑制Bcl-2 蛋白的表达[35]，且对Caspase-3 的表达水平调节存在浓度和时间依赖性[36]，从而诱导细胞焦亡；还可抑制Caspase-11 介导的NLRP3 激活，从而下调LPS＋Aβ 诱导BV2 细胞的炎症反应，抑制非经典途径的神经细胞焦亡，发挥神经保护作用[37]。槲皮素能抑制对 Caspase-1 的激活具有催化作用的NLRP3，下调IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌过程[38-39]，从而抑制神经元细胞焦亡。槲皮素还能上调Bcl-2 及下调Caspase-3 基因的表达，从而抑制细胞焦亡[40]。熊果酸能够显著上调活性形式的Caspase-3 表达，阻断STAT3 的核易位进而阻断STAT3 激活[41]，从而发挥诱导细胞焦亡的作用。山柰酚通过抑制Caspase-1的表达和活性，进而抑制GSDMD 的分解，发挥抗细胞焦亡作用[42]。

分子对接结果表明，潜在的药物靶点组合数量可能远多于TCMSP 收录的药物-靶点组合，这表明仍有大量中药有效成分干预细胞焦亡的作用关系有待进一步探索。此外，橙皮苷（hesperidin）和芦丁（rutin）在分子对接中表现良好。橙皮苷可上调Bax 表达，从而激活Caspase-3 依赖性内在通路，对HepG2 和SH-SY5Y 细胞的增殖过程产生显著的抑制作用[43]，本研究推测，这与Caspase-3 诱导GSDME 裂解为GSDME-N 片段，进而诱导细胞焦亡过程有关。芦丁通过抑制Caspase-1、NLRP3 和IL-1β 的表达[44-45]，发挥抗细胞焦亡作用。

根据筛选结果，综合中药的度值与所包含的靶点数，比较重要的中药有麻黄、葛花、虎杖、桑白皮、山豆根、鸡血藤等。基础研究表明，麻黄通过抑制包括Caspase-3 在内的多种Caspase 活性以显著抑制肝细胞程序性死亡，还可激活IL-6 诱导的STAT3[46]，这可能是麻黄抑制细胞焦亡的机理。动物实验表明，虎杖醇提取物能够抑制NLRP3 与Caspase-1 的表达，从而抑制小鼠急性痛风性关节炎[47]，这可能是虎杖发挥抗细胞焦亡作用的机制。桑白皮能够促进Caspase-3等多种Caspase 的活化，从而诱导细胞程序性死亡[48]，这可能是桑白皮诱导细胞焦亡的作用机制。山豆根可下调肿瘤细胞中Bcl-2 的表达，上调Bax 的表达，从而对肿瘤细胞的焦亡产生诱导作用[49-50]。鸡血藤可通过下调Bax 和Caspase-3[51]，从而抑制细胞焦亡。

本研究结果表明，潜在可调节细胞焦亡的中药药味以苦、辛、甘为多。《素问•藏气法时论篇》有“苦坚”“辛散”“甘缓”的记载。苦味药物可泻下、清利热邪，临床用于热证；辛味药物可发散表邪、行气活血，临床用于表证及气滞血瘀证等；甘味药物可补益正气、和中健脾、缓急止痛，临床用于虚证、疼痛等。药性以寒居多，寒性药物多具有清热泻火、凉血解毒、泻热通便等作用，适用于热证。中药归经以肝、肺二经为主。肝主疏泄、主藏血、主升，肺主气的宣发与肃降，肝、肺气机运行正常是人体气血调和的保证，也是整个机体功能正常运行的重要基础。由此推测，细胞焦亡的中医病理基础应为肝升与肺降功能失常，肝气郁滞，肺不宣降，气郁化火，气滞血瘀，不通则痛，久而为虚损性疾病，故而细胞焦亡的中医内涵多为热证、表证、气滞血瘀证及虚证、疼痛性疾病等，中医药干预细胞焦亡应从清热泻火、行气活血、补益和中、缓急止痛等方面论治。

本研究通过网络药理学研究方法，从与细胞焦亡过程相关的蛋白入手，建立细胞焦亡相关的靶点-化合物-中药网络，从而分析并挖掘中药干预细胞焦亡过程的潜在分子基础及可能的作用机制，尝试从现代研究层面解读中医药理论，为中医药干预细胞焦亡及相关疾病提供方法借鉴，也为进一步开发干预细胞焦亡的药物提供新思路。由于网络药理学的研究方法对靶点-化合物-中药网络关系只能进行定性分析，今后将进一步探讨构建更为系统的研究模型，以分析其中的定量关系。