薄皮甜瓜品种翡翠的SSR快速鉴定技术的应用

邓竹根，夏伟伟，倪婷婷，杨卓，乔宇，贾永静，李曼

（1.安徽江淮园艺种业股份有限公司，合肥，230031；2.安徽农业大学）

甜瓜（Cucumis mel oL.），又称香瓜，是葫芦科黄瓜属一年生蔓性草本植物，是人们喜爱的十大水果之一[1]。薄皮甜瓜又称中国甜瓜，可连皮食用，薄皮甜瓜品种翡翠品质佳、抗逆性好、含糖量高，推广面积大，深受消费者喜爱。

农作物品种的快速鉴定技术不仅可以保护种子生产企业的权益，还是净化种业市场的种业保障[2]。SSR标记，也称简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR）[3]，因具有重复性好、稳定性高、多态性丰富等特点，而成为有价值的遗传标记被广泛应用[4]，同时SSR检测标记技术对样品DNA质量要求极低，用普通的碱煮法提取即可，甚至几分钟便可提取，可实现种子纯度快速鉴定[5，6]。与传统田间鉴定相比，其不仅不受天气影响，而且不受时间空间限制，可以随时随地地对样本进行室内检测鉴定，广泛应用于多种作物杂交种纯度鉴定和指纹图谱建立[7～12]。SSR分子标记法是通过双亲本基因上的差异来鉴定杂交种纯度，而大田则以表型鉴定为依据，如果分子鉴定和表型鉴定不一致就会导致鉴定误差。

本研究利用甜瓜8对特异性SSR分子标记对薄皮甜瓜品种翡翠进行鉴定，通过田间人为掺杂试验和对往年田间鉴定的翡翠进行鉴定试验，结果发现，其中1对特异性SSR分子标记可以用于薄皮甜瓜品种翡翠的纯度鉴定。

本研究的目的是利用SSR分子标记筛选出可以进行室内纯度鉴定的引物，并利用该引物，对实际样品进行快速检测，实现室内检测的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

翡翠品种的亲本由安徽江淮园艺种业股份有限公司亲本资源库提供，翡翠F1代商品种由该公司质保部提供。

1.2 试验设计

首先，对翡翠亲本及F1代种子进行SSR引物筛选，确定亲本差异、能用于F1代鉴定的SSR引物；其次，开展田间人为掺杂试验，进行室内与大田一一对应鉴定，验证室内分子纯度鉴定的准确性；最后，将往年翡翠F1代田间鉴定的样本进行室内分子鉴定，验证符合率，确定薄皮甜瓜品种翡翠的SSR快速鉴定技术的实际应用。

室内分子鉴定，于2020年4月在合肥市长丰县吴山镇桥冲村江淮园艺示范园分子实验室完成；大田鉴定，于2020年4～5月在合肥市长丰县吴山镇桥冲村江淮园艺示范园示范大棚内完成。

1.3 药品及生化试剂

试验过程中用到的化学药品均购自国药公司；Taq酶、dNTPs、DNA Marker购自康为世纪生物科技有限公司，PCR所用的SSR引物[7，13～15]由上海英骏生物技术有限公司合成，其他试剂由合肥化学试剂公司提供。

1.4 本文所选鉴定SSR引物信息

翡翠纯度鉴定SSR引物信息见表1。

表1 甜瓜翡翠纯度鉴定SSR引物信息

1.5 DNA提取

①CTAB法 用CTAB法提取甜瓜亲本材料叶片总DNA。用超微量浓度测定仪检测DNA的浓度和质量，并根据检测浓度的结果将DNA稀释到50～100 ng/L。

②热碱法 根据农作物种子检验规程选取翡翠F1代种子250粒左右，浸种催芽后，待芽长至1 cm左右时，置于96孔板中，共2板，加入100μL NaOH溶液（0.2 mol/L），100℃加热60 min，冷却后加入10μL Tris-HCl溶液（pH值6.0），混匀短暂离心，上清液即为DNA模板。

1.6 PCR扩增

PCR反应体积为20μL：其中ddH2O为13.5μL，10×PCR缓冲液（含Mg2+）为2.0μL，dNTPs为0.5μL，上、下游引物各1μL，模板DNA为2μL，Taq酶为0.1μL。在基因扩增仪上进行片段扩增。反应的步骤为：94℃预变性3 min，94℃45 s，53℃30 s，72℃30 s，32个循环，最后72℃3 min，25℃保存备用。

1.7 电泳拍照

电泳采用3%（w）浓度的琼脂糖，电泳方法为电压220 V、电流100 A、电泳40 min，结束后置于凝胶成像系统中拍照分析。

1.8 数据处理方法

以筛选出来的SSR分子标记为扩增引物，对送检样本进行PCR扩增，通过带型统计，用具有该品种特异带型的种子粒数占检测样本种子粒数的百分率表示纯度。对未扩增出条带的样本需从待检样本总数中扣除，计算公式如下：纯度（%）=（具有本品种特异带型的种子粒数/出现带型的样本总数）×100。

2 结果与分析

2.1 亲本材料引物筛选

利用甜瓜8对SSR引物对翡翠品种亲本及F1代进行筛选，筛选出4对有差异的引物（图1），分别为TG1、TG4、TG5和TG7。

从图1可知，引物TG1显示父母本差异明显，但是纯度鉴定时父本条带不易区别，因为父本条带在F1中没有体现出来。引物TG5显示父母本与F1差异明显，但是父母本差异微弱。引物TG4和TG7显示父母本条带差异明显，而且能够在F1代中体现。综合考虑，笔者选用引物TG4对翡翠品种进行室内分子纯度鉴定。

图1 翡翠品种亲本及F1代引物筛选PCR产物电泳图谱

2.2 田间人为掺杂鉴定结果

田间鉴定于2020年4～5月在合肥市长丰县吴山镇桥冲村江淮园艺示范园示范大棚内完成。为了验证室内鉴定的准确性，公司生产人员在大田定植时，人为添加母本材料在商品种内一同定植并编号记录，2周后室内按照定植顺序采样检测，为与生产编号保持一致，按照定植间距，判断植株死亡情况，分子检测结果如图2所示。结果显示，室内鉴定出8株杂株，编号为：4、13、17、21、27、32、36和42号。其中，5、9、37和39号植株田间死亡，与生产人员人为掺杂编号相同，符合率100%。另外，如图2所示，41号显示为父本条带，在生产制种过程中，不可能出现父本杂株，室内标记为异株。结果表明，甜瓜SSR引物TG4室内分子纯度鉴定与田间实际鉴定结果相符。

图2 田间人为掺杂后鉴定结果

2.3 室内鉴定应用

为了进一步验证室内纯度检测的可靠性，公司将往年销售的翡翠品种合格的种子（田间鉴定结果为98.4%）安排室内检测。根据农作物种子检验规程选取192粒种子的芽进行纯度检测，检测结果如图3所示，在192个芽中，鉴定有效数为187个，其中杂株5个（图3、4红色椭圆圈），纯度为97.3%，与大田往年鉴定结果符合率高达99%以上。结果表明，该SSR引物的纯度鉴定结果真实、快速、可靠，可以替代大田鉴定。

图4 第二板翡翠品种室内检测结果

3 讨论与结论

对比试验数据发现，室内鉴定结果与田间鉴定存在一定的误差，原因可能有2点：①田间鉴定株数在70株左右，而实验室鉴定种子数为192粒，导致最后统计结果有偏差；②田间鉴定主要由有经验的农艺师依据品种的主要田间表型进行鉴定，而SSR分子标记法未能准确定位相关表型，导致结果偏差。

本研究利用8对甜瓜SSR引物对翡翠品种的亲本进行筛选，筛选出4对有差异的引物，再结合商品F1代进行验证得到最优引物（引物编号TG4）。结合田间一一对应鉴定试验和对比往年田间鉴定试验发现，室内快速鉴定结果与田间鉴定结果符合率高达99%以上。从鉴定时间和成本角度考虑，室内鉴定明显优于大田鉴定。该技术现已在本公司开展实际应用。