乳制品中碱性磷酸酶检测的影响因素及控制措施

周 玲，徐广新

1 扬子江药业集团南京海陵药业有限公司，江苏南京 210046

2 扬州市扬大康源乳业有限公司，江苏扬州 225004

关键字：碱性磷酸酶（ALP）；乳脂肪；复活

0 引言

碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）广泛存在于自然界中，它是一种分子质量为187 kDa的蛋白质，其等电点为5.4～6.0[1]。生物体内各组织和器官都含有ALP，ALP在生物体内主要参与一些脱磷酸反应，它的活性是生物体内一个重要的生理评估指标。牛奶中也含有大量的ALP，由于其热稳定性略高于乳中的大部分致病微生物，比如结核杆菌、李斯特菌等，因此，将其作为巴氏杀菌热处理评估的活性指标。当牛奶热处理强度足以使ALP活性检测结果为阴性时，则说明其他病原微生物也被完全灭活，因此，ALP的活性指标是乳制品加工业里非常重要的指标，标志着乳制品巴氏杀菌的成功与否。但牛奶微生物所含有的ALP可能会造成检测假阳性现象或干扰测试结果。另外，不同品种奶牛、不同地域、牛奶中初始浓度、检测温度、脂肪含量等因素均会对牛奶巴氏杀菌后的检测结果有影响。本文综合阐述相关研究，提出控制措施，以对生产过程中出现的异常情况进行指导。

1 不同品种牛奶成分的一般差异

牛奶成分不同取决于品种（如奶牛、水牛、牦牛）、不同时期（哺乳期、乳房感染期）、喂养条件、环境条件等因素。由表1可知，奶牛总干物质含量显著低于水牛和牦牛，这主要由于牛奶中总酪蛋白和脂肪含量均小于水牛奶和牦牛奶。ALP易富集于脂肪球膜上，脂肪含量对后期ALP检测具有重要影响，最终导致奶牛中的原料乳ALP水平显著低于水牛乳和牦牛乳。

表1 不同品种奶牛主要乳成分表[2]

2 乳脂肪的影响

ALP很容易被脂肪球吸收，因此，产品中的脂肪含量会影响最终检测结果。产品中脂肪含量越高，终产品ALP水平越高。另外，通过对奶牛中ALP水平的检测变化，也证实了其本身与乳脂球膜具有相关性。后期，通过对生鲜乳进行脱脂处理工艺，发现了脱脂后的生鲜乳ALP水平显著低于全脂生鲜乳，脱脂乳中ALP水平分别为全脂生鲜乳和奶油中ALP水平的47.0%和5.0%。研究表明，将巴氏杀菌处理后的生鲜乳ALP限值控制在350 mU/L以下才能满足相关要求[3]。

3 干扰化合物的影响

目前ALP的检测方法主要包括电化学发光法、电化学法、比色法、荧光法、色谱法等[4]。对于当前巴氏杀菌乳中ALP快速检测通常采用荧光法进行比色分析，基于苯酚和其衍生物的方法进行读数，但易受到有色乳制品（如草莓乳）的干扰。此外，生鲜乳中土霉素和青霉素的抗生素残留物会造成比色法中假阳性结果，也可能是生鲜乳中含有活性酚基成分或添加剂造成假阳性结果的出现。同时，生鲜乳中类黄酮、糖类、抗坏血酸等成分也会抑制ALP活性，并造成检测结果偏低。ALP的热稳定性也会受到氯化钠和乳糖的影响，其中氯化钠会降低生鲜乳中ALP的热稳定性，而乳糖会增加ALP的热稳定性，并影响巴氏杀菌处理效果及ALP检测水平[5]。

4 微生物ALP的影响

除了牛奶内源ALP，牛奶中还存在微生物ALP，当进行巴氏杀菌乳中ALP检测时，有可能因为微生物源ALP而产生假阳性现象。这些微生物源ALP的热稳定性要强于牛奶内源ALP，造成内源与微生物源的ALP难以区分。生产过程存在的微生物可能产生微生物磷酸酶和其他可能干扰残留磷酸酶测试的物质，这就导致生鲜乳经过不同时间贮存后，其初始ALP水平会发生变化。目前传统的检测方法无法直接区分内源和微生物源的ALP，若巴氏杀菌乳ALP水平较高，取一部分样品重新巴氏杀菌处理后ALP水平没有明显降低，这可能是微生物ALP的存在影响了最终的检测结果，这主要是由于微生物ALP耐热性能要高于生鲜乳中存在的ALP[6]。

5 ALP复活

ALP在一定条件下可以恢复活性，简称ALP复活。Peereboom[7]在1940年首次观察到，尽管刚灭菌处理后的高温灭菌乳（UHT）中的ALP可能检测为阴性，但随后在储存的UHT牛奶中ALP检测结果可能为阳性。而Wright等[8]发现初始检测呈阴性的巴氏杀菌乳在经过22.0～37.0 ℃保存后，ALP结果又重新呈现阳性，并推断ALP的复活与乳制品巴氏杀菌过程的温度、时间以及运输储存的温度时间条件并没有明显的线性关系，并且与乳制品中乳脂含量和抗坏血酸含量没有特异性关系。Lorenzen等[9]发现，在环境温度下储存148 天的UHT牛奶中，3.5%全脂乳中的ALP活性从20 mU/L增加到454 mU/L，1.5%低脂乳中的ALP活性从80 mU/L增加到3 248 mU/L，并发现高于71.7 ℃的温度下进行巴氏杀菌的牛奶更容易发生ALP复活。对于ALP的复活造成的假阳性结果，在待确认的阳性样品中加入含镁离子的溶液，经过相应温度和时间的培养，再次检测ALP活性，当测定结果不发生变化或者增强时，则可认为该阳性结果为复性造成的假阳性结果[3]。

6 控制措施

6.1 加强人员培训

积极组织检验人员对于《T/TSSTIA 008-2019巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定 发光法》标准进行学习，并制定ALP活性检测的操作规程，确保检验人员的操作规范性，通过对巴氏杀菌乳在同一时间内的ALP检测结果判定消毒效果，确保产品合格，避免假阳性或ALP复活对检验结果的干扰。另外，定期组织检验人员参加北京奶业创新联盟举办的培训活动，提升关键岗位人员的检验水平。

6.2 优选检验设备

目前巴氏杀菌乳ALP检测通常采用荧光法快速检测，采用国内外公司在售的试剂管和配套检测仪器，但不同型号设备间的准确度和精密度存在差异，后期应对标准样品检测结果的准确性和重复性进行验证，企业应对巴氏杀菌乳成品进行上机测试及验证，确保检验设备灵敏度符合优质巴氏杀菌乳要求。

6.3 做好比对工作

对不同批次的试剂进行比对校准，对不同检验员的检验结果进行不定期交叉比对，保证检验结果的可信度。一方面与其他检验机构进行沟通，充分利用质检所和第三方检验机构的合作关系，开展检验项目比对，确保检验结果重复性高。另一方面实验室内部2名检验员进行同时检验，严格按照检验规范，明确检验项目，填写比对记录，确保检验结果的准确性。

6.4 建立实验室数据库

针对生鲜乳指标的差异性，各实验室可根据实际情况建立ALP检测结果与脂肪含量和其他干扰物质间的相关性，有利于对异常数据进行分析。这主要由于实验室涉及人员较多、设备种类也比较复杂、来样检验品种较多，因此在管理上必须采取规范的制度才能确保所有检验结果完备齐全，不仅为人员、设备、检验资料的管理提供基础，也为日常生鲜乳及巴氏杀菌乳制品的产品稳定性提供数据支撑。

6.5 加强信息沟通

做好牧场信息饲养情况精准对接，以利于对ALP数据异常系统分析。由于检验结果可能受到假阳性结果的干扰，因此存在检验结果与实际不相吻合，容易造成检验员的检验水平受到质疑，如果与牧场或加工环节不能进行很好的沟通，不仅给奶源基地和加工厂造成不合格品处置造成的损失及浪费。只有检验部门与加工和奶源基地建立起良好的沟通机制，才有利于提高检验质量。