规模化奶牛场犊牛腹泻的病原检测与分析报告

阮继湘，刘文晓，江 波，许 健，李永清，程 晶＊

1 中牧实业股份有限公司，北京 100070

2 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097

0 引言

随着我国养牛业的持续发展，犊牛腹泻病的发生呈上升趋势。引起该病的原因很多，主要分为感染性和非感染性。若没有及时找到病因进行有效治疗，则会影响新生犊牛的生长和繁育，严重者甚至出现死亡，造成经济损失。因此，对患病犊牛做出及时准确的诊断和治疗，可以保证牛只健康，促进养牛业持续健康发展。

2021年入夏以来，收到内蒙古某规模化奶牛场牛群出现犊牛腹泻病况的报告。患病牛涉及1～6 月龄犊牛，牧场256头犊牛中，20 头出现腹泻症状。主要症状是持续腹泻20 多天，粪便呈黄绿色水样，部分犊牛粪便中带有血液和黏液。大部分出现脱水和衰弱；体温38.8～39.3 ℃；听诊心跳快，肺部湿罗音，瘤胃处有钢管音。曾以头孢嘧啶和恩诺沙星治疗，但效果不佳，并出现了3 头牛死亡，约占发病牛的15.00%。为查明腹泻发生和流行的原因，对腹泻犊牛的血液和粪便进行细菌、病毒和寄生虫的病原学和核酸检测，对腹泻犊牛血清进行病毒抗体检测。

1 材料与方法

1.1 病料

对腹泻犊牛进行现场采样，采集腹泻犊牛血液及血清样品各20 份。直肠粪便采样，收集水样粪样6个，稀便粪样3 个，共计9 个粪样。

1.2 血清抗体检测

用牛副结核、牛病毒性腹泻/黏膜病酶联免疫吸附剂测定（ELISA）检测试剂盒（IDEXX公司）分别检测牛副结核分枝杆菌抗体以及牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体，具体操作步骤按试剂盒说明书进行；同时以病毒中和试验检测牛轮状病毒和冠状病毒抗体。

1.3 细菌分离鉴定

选择腹泻症状严重的病牛直肠粪便，以Cary-Blair氏运送培养基（一种专门用于空肠弯曲杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌等肠道致病菌标本的采集、运输和短期保存的培养基）保存运输。取少量样品直接划线接种于麦康凯平板用于大肠杆菌的分离；进而利用沙门氏菌专用亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行37.0 ℃过夜培养，增菌液划线接种于沙门氏菌显色鉴别培养琼脂平板，用于沙门氏菌的分离培养；最后利用Bolton肉汤于微需氧产气袋的厌氧罐中37.0 ℃过夜培养，将增菌液划线接种于弯曲杆菌选择培养基（CCDA平板），于37.0 ℃厌氧罐中培养48 h。挑取生长一致的单个菌落涂片镜检并进行生化试验鉴定及聚合酶链式反应（PCR）鉴定。

弯曲菌三重PCR鉴定：取疑似弯曲菌培养菌液0.5 mL，离心后去除上清液，菌沉淀加入50.0 μL纯水重悬，煮沸5 min，离心后取上清液用于三重PCR检测。三重PCR检测方法参考文献[2]进行，即同时扩增弯曲菌属16S rRNA基因（857 bp）、空肠弯曲菌mapA基因（589 bp）和结肠弯曲菌ceuE基因（462 bp）。

1.4 寄生虫卵检测

取腹泻犊牛粪便约10.0 g，加饱和食盐水100.0 mL混匀，通过60 目铜网过滤于小烧杯中，立即吸取滤液至小青瓶中形成凸面，静置30 min后，以清洁载玻片轻触液面于显微镜下检查虫卵[3]。

1.5 病毒检测

分别取磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的粪便上清以及血液样品200.0 μL，使用病毒/细菌核酸柱式提取试剂盒提取样品核酸（北京森康生物技术有限公司）。使用牛病毒性腹泻荧光RT-PCR检测试剂盒（北京森康生物技术有限公司）检测牛病毒性腹泻病毒。将提取的样品核酸反转录后进行轮状病毒VP6基因以及牛冠状病毒N基因PCR扩增，检测引物[生物工程（上海）股份有限公司合成]见表1[2]。25.0 μL PCR反应体系如下：2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，扩增样本cDNA/DNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR扩增条件为：94.0 ℃，2 min；94.0 ℃，30 s；55.0 ℃，30 s；68.0 ℃，40 s；68.0 ℃，5 min，40 个循环。取扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶核酸电泳后，用凝胶成像系统进行检测。

表1 检测牛冠状病毒及轮状病毒的引物序列

2 结果

2.1 血清抗体检测

对所采集的20 份腹泻犊牛血清进行腹泻相关病原的ELISA检测。结果表明，所有样品的牛副结核杆菌抗体均为阴性，牛病毒性腹泻/黏膜病病毒抗体阳性率为65.00%；病毒中和试验结果显示，牛轮状病毒抗体阳性率25.00%，而牛冠状病毒抗体15.00%。

2.2 致病性细菌分离鉴定

对收集的9 份牛直肠粪便，进行不同菌落的形态观察、生化试验以及16sRNA PCR鉴定。PCR结果未发现产肠毒素型大肠杆菌和肠炎沙门氏菌等与下痢相关的致病菌株，但41号及57号牛直肠粪便样品在弯曲菌选择培养基CCDA上生长菌落，经弯曲菌三重PCR鉴定，其中1 株为结肠弯曲杆菌，另1 株为空肠弯曲杆菌（图1）。

图1 牛弯曲菌三重PCR 鉴定结果

2.3 寄生虫卵检测

对收集的9 份牛直肠粪便进行镜检，7 份粪样中发现球虫卵囊，球虫卵囊检出率达77.78%。同时，含有球虫卵囊的粪样中，有1 份粪样发现蛔虫卵，2份粪样发现其他线虫卵。

2.4 病毒检测

针对牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、轮状病毒以及冠状病毒的结构蛋白编码基因的检测结果表明，在20份牛血液和9 份粪便样品中，57号牛血液及粪便样品为牛病毒性腹泻/黏膜病病毒核酸检测阳性，粪便样品中牛冠状病毒核酸检测阳性；此外，9号牛的粪便中检测到牛冠状病毒；28号牛的粪便样品同时检测到轮状病毒和牛冠状病毒；41号牛的血液样品中检测到牛冠状病毒，粪便样品中含有牛轮状病毒；55号牛的粪便样品中则含有牛冠状病毒（图2）。

图1 牛弯曲菌三重PCR 鉴定结果

3 分析与讨论

犊牛腹泻是规模化奶牛场常见的一种消化系统疾病，一年四季均可发生。主要表现为急性或慢性下痢，不仅使奶牛的抵抗力变差，生长缓慢甚至引起死亡。调查资料表明，规模化奶牛场的犊牛腹泻在断奶前后的患病率和发病率通常分别为3.0%和0.5%，而本次牛场暴发的犊牛腹泻率为7.81%，远高于目前的平均发病率。

该病在不同时期存在不同的病因，一般可以分为营养性腹泻和传染性腹泻。营养性腹泻是由于营养因素和饲养管理不当而造成的消化不良，可以通过改变喂饲方式而改善；但传染性腹泻的致病因素比较复杂，包括牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、冠状病毒、轮状病毒等病毒，也可能因肠炎沙门氏菌、产毒型大肠杆菌、空肠弯曲杆菌和结肠弯曲菌引起。从实验室收集的病料检测结果来看，未发现肠炎沙门氏菌以及产毒型大肠杆菌，可能与病牛接受了抗菌药物治疗有关。但牛病毒性腹泻/黏膜病病毒，空肠弯曲杆菌、结肠弯曲菌，牛球虫等病原感染严重，尤其是与腹泻相关的病毒，如牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状腹泻病毒等，不仅存在于腹泻犊牛的粪便中，甚至引发了病毒血症，因此，多病原同时感染或继发感染是规模化奶牛场流行性犊牛腹泻的主要因素。

这些病原体的感染和致病与气候潮湿、多雨造成牛场污秽的环境密切相关。夏季正是奶牛腹泻的高发和流行时期，奶牛场需要对该病高度重视。一是确保牛舍干净的环境卫生和通风条件，并采取严格消毒等综合防控措施；二是定期对全群牛进行血清学检查，及时掌握病毒在牛群中的流行状况，发现阳性牛，要坚决隔离、淘汰，以防疫情扩大；三是要做好牛只的定期驱虫工作，以免球虫等寄生虫感染破坏牛肠上皮细胞造成继发感染。

治疗腹泻，补液是关键。腹泻发生时即灌服畜禽专用营养补液盐，能有效缓解腹泻牛出现脱水、电解质失衡和酸中毒等，同时应该根据药敏试验结果，使用敏感抗生素进行治疗。针对此次疫情中分离的牛弯曲菌进行了药敏试验，筛选到具有高度抑菌作用的马坡沙星等喹诺酮药物，治疗效果明显。目前，我国已有牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗上市，建议对感染严重的牛群实施预防接种。