胞外多糖对酸奶稳定性的研究

王 新，张居典，邵景海，秦 平

北大荒完达山乳业股份有限公司，黑龙江哈尔滨 150090

0 引言

乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌发酵产生的，分泌于细胞外，常渗入培养基中的一种糖类化合物[1]。一般为黏液或荚膜多糖等水溶性多糖，是一种天然高分子聚合物[2]。作为一种新型的天然食品添加剂，乳酸菌胞外多糖因独特的生理功能和产业潜力而备受研究者青睐。在生理功能上，胞外多糖具有良好的抗肿瘤、保护机体组织细胞、增强抵抗力和降低胆固醇等活性[3]。在物化特性上，研究表明，乳酸菌胞外多糖不仅能增加发酵乳的黏度，减少乳清析出，提高发酵乳的回复性和抗剪切力，还能显著提高发酵乳的持水力[4]，提供蛋白的稳定性，是一种天然的增稠剂及稳定剂。胞外多糖在酸奶中的含量一般为50.0～2 700.0 mg/L，对酸奶质构的影响主要是胞外多糖的结构和含量与乳蛋白发生相互作用所致。本研究对不同菌种发酵过程中产生的胞外多糖含量及其对产品质构特性等方面的影响进行分析研究，为以后胞外多糖含量在酸奶中的研究与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

全脂生牛乳，脱脂牛奶，白砂糖，试验用发酵剂1号、2号、3号、4号、5号为不同型号发酵剂（成分均为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌），乳酸菌培养基（MRS）等。

1.2 试验器材

天平、搅拌桨、均质机、水浴锅、恒温培养箱、黏度计、离心机、pH计、紫外可见分光光度计、离心机、烧杯、称量勺、温度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种胞外多糖产量的测定

（1）胞外多糖的分离

发酵剂1号、2号、3号、4号、5号，接种到经灭菌12%脱脂乳培养基中，在最适温度37 ℃下培养24.0 h。接种2%的发酵液于MRS培养基中，在42 ℃下培养15.0 h。冷藏过夜。

取10 mL乳酸菌发酵液，4 000 r/min离心15 min，取上清液，用浓度为1 mol/L的NaOH将上清液pH值调至7.5，加入1/10体积的胰蛋白酶液（质量浓度为3 g/L，现配现用），40 ℃水浴酶解2.5 h。加入1/3体积Sevag液（氯仿∶正丁醇=3∶1，体积比），振摇30 min后，4 000 r/min 离心15 min，去除沉淀，重复1 次。加入3～5 倍体积的体积分数为95%的乙醇，充分振荡（多糖呈絮状沉淀析出），转速为4 000 r/min离心15 min，得沉淀。将沉淀用丙酮洗涤脱水2 次，干燥得白色粉末即为多糖[5]。

（2）标准曲线绘制

将50 mg标准葡萄糖定容于500 mL容量瓶中。各种试剂按照表1所示顺序加入后混匀，室温放置显色20 min后于490 nm波长下测定吸光值，以2.0 mL水按照同样的显色操作作为空白进行调零，横坐标为多糖含量，单位为μg，纵坐标为光密度值，制作标准曲线[6]。

表1 葡萄糖标准曲线各浓度 单位：mL

（3）胞外多糖质量浓度的测定

采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖质量浓度，用葡萄糖绘制标准曲线。胞外多糖含量的测定：准确吸取10 mL蒸馏水溶解胞外多糖样品，吸取样品溶液0.2 mL于试管中，然后按葡萄糖标准曲线制备步骤操作，测定样品的吸光度，由标准曲线的回归直线方程求出对应的糖质量浓度，再乘以样品稀释度即得各菌株的胞外多糖质量浓度。

1.3.2 酸奶样品制作

使用标准化处理过的生牛乳，经6 5 ℃，180～200 bar均质处理、95 ℃，300 S杀菌、降温至42 ℃，分别添加发酵菌种1号、2号、3号、4号、5号，发酵后测定试验样品状态口感、黏度、持水性、耐热性。

（1）产品状态口感测定

样品发酵后至pH值4.4，破乳降温储存，后熟12.0 h，由15 人组成品评小组，对产品的外观状态、口感进行评价计分（表2）。

表2 状态口感评定标准

（2）产品黏度测定

产品发酵至pH值4.4，破乳降温至25 ℃，BROOKFIELD DV3T 黏度计 S63 号转子，转速20 r/s，测定30 s时样品的黏度。每个样品做平行试验3 次，取平均值。

（3）产品持水性测定

产品发酵至pH值4.4，破乳降温至25 ℃，用离心管取样品5.0 mL，并测定样质量W1后，放入离心机以3 000 r/min离心20 min后，取出离心管静置10min，除去上清液，测残余物的质量W。酸奶持水力为：持水力（%）=（W/W1）×100%[7]。

（4）产品耐热性比较

为验证比较菌种产生胞外多糖对酸奶受热保护性状，在大量的前期试验基础上，采用生牛乳添加菌种进行发酵，发酵至pH值至4.4进行破乳降温，降至25 ℃，采用75 ℃水浴对酸奶进行升温杀菌，记录酸奶升温过程中的变化，比较酸奶杀菌过程中蛋白变性情况。

2 结果与分析

2.1 胞外多糖产量的测定

2.1.1 绘制葡萄糖标准曲线

以葡萄糖的含量作为横坐标，490 nm下吸光值为坐标做出的标准曲线（图1），该曲线与线型方程y=0.0086x-0.0031拟合良好，R2=0.9994，葡萄糖的含量为10～100 μg/mL。

图1 葡萄糖绘制标准曲线

2.1.2 胞外多糖产量测定

采用苯酚-硫酸法进行测定5 种发酵菌种胞外多糖产量，如图2所示。菌种4号胞外多糖产量最高，其胞外多糖产量为568.5 mg/L，其后依次为2号413.5 mg/L，1号352.3 mg/L，菌种3号284.3 mg/L，菌种5号174.8 mg/L。

图2 不同菌种胞外多糖的产量

2.2 产品状态口感测定

分析不同发酵菌种1号、2号、3号、4号、5号制得产品，对其乳感官状态进行评价。品评小组从外观状态、口感、光滑度几个方面对试验产品进行品评，见表3。结果显示，4号菌种发酵产品质构状态评分最佳。结合上述，胞外多糖产量测定结果，说明胞外多糖能赋予产品更好的口感和状态。

表3 状态口感评定结果

2.3 产品产黏测定

分析不同发酵菌种1号、2号、3号、4号、5号对产品黏度的影响，从图3可以看出，发酵菌种4号所制得酸奶黏度最高，为2 200 cp；其后依次为2号菌种1 900 cp、1号菌种1 600 cp、3号菌种1 400 cp、5号菌种1 000 cp。可以看出产品黏度与菌种胞外多糖产品正相关。胞外多糖可提高酸奶产品黏度，改善质地，是一种很好的天然生物增稠剂[8]。乳酸菌胞外多糖的种类非常多，结构也多变。其产品黏度的贡献取决于产生胞外多糖的数量与胞外多糖的结构[9]。

图3 不同菌种对应产品黏度的测定

2.4 产品持水性测定

分析不同菌种发酵产品持水性的比较。通过图4可以看出，发酵菌种4号所制得酸奶持水能力最高，随菌种产生胞外多糖能力的增加，产品持水性成增长趋势。这可能是乳酸菌产生的EPS增加了发酵乳的持水性，减少了乳清析出。产EPS的发酵乳含有相对大的孔，EPS在这些微孔里使蛋白质网络形成更厚、更浓密的蛋白质凝胶通道，这种结构更有利于防止发酵乳脱水析出[10]。

图4 不同菌种对应产品持水性的测定

2.5 产品耐热性比较

分析不同菌种发酵产品耐热性的比较。通过图5可以看出，发酵菌种4号所制得酸奶耐热到75 ℃才开始有蛋白变性，随菌种产生胞外多糖能力的增加，产品蛋白耐热稳定性成增长趋势。多糖和蛋白之间发生的相互作用主要有非共价作用和共价作用两种[11]。非共价作用主要有强的静电作用和弱的相互作用（氢键、范德华力、疏水相互作用等）。共价作用主要通过Maillard反应产生[12]。两者的相互作用会改善蛋白质的溶解性、热稳定性等[13]。

图5 不同菌种对应产品耐热性的测定

3 结论

乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制品特殊物化特性，可改善酸奶的质地口感，增加酸奶的黏性、流变性，提高酸奶的持水性，防止乳清析出，增强酸奶的耐热强度等。此外，胞外多糖还具有生物活性，如免疫活性、抗肿瘤等。在酸奶生产过程中，常出现黏度低、凝块破碎和大量乳清析出等问题，这些问题可以通过使用高产胞外多糖的发酵菌种解决。使用高产胞外多糖的发酵剂生产出来的酸奶与低产胞外多糖的发酵剂相比，具有口感状态好、黏度高、持水性好的优势，在常温酸奶的使用中，高产胞外多糖的发酵剂生产的酸奶具有耐热性强的优势。