可利霉素对临床分离菌的体内外研究

何苗 程琳 李丹宇 吴喜成 谷普庆郑歆周黎明△

（1. 四川大学华西基础与法医学院药理教研室 四川 成都 610041；2. 沈阳同联集团有限公司 辽宁 沈阳 110042）

可利霉素（Carrimycin，商品名必特）是中国医学科学院医药生物技术研究所与沈阳同联集团有限公司共同开发的国家一类新药，于2019年6月获批上市。可利霉素是根据细菌耐药特点进行设计，通过导入外源基因进行催化形成异戊酰基侧链的生物合成药物。是多组分小分子化合物的混合物。其主要成分包括异戊酰螺旋霉素Ⅲ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅰ三个主要成分（见图1）及一定量的丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素Ⅲ、丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素Ⅱ等9种成分组成的混合化学物[1]，其结构属于大环内酯类抗菌药物。可利霉素可阻断50s 核糖体中肽酰转移酶的活性来抑制细菌蛋白质合成，从而达到抑菌作用，并且可利霉素可结合过氧化物清除酶，诱导过氧化物破坏DNA等生物大分子，从而达到杀菌的作用。此外可利霉素在体内还可促进中性粒细胞迁移于炎症部位，破坏并吞噬细菌及受损细胞，还可增强巨噬细胞的吞噬作用，从而增强机体抗感染作用。药物代谢动力学研究证实[2-3]它比螺旋霉素体内半衰期更长，部分代谢产物仍然保持抗菌活性；组织渗透性增强，还具有明显的抗生素后效应。但是前期研究表明可利霉素体内抗菌作用较强，但是体外抗菌作用对有些细菌有效，而对有些细菌作用较弱，本研究的目的是进一步明确可利霉素对临床分离鲍曼不动杆菌和部分耐药菌的体内外的抗菌作用。

图1 可利霉素的主要成分结构示意图

1 实验材料和实验方法

1.1 实验材料

药品：可利霉素，由上海同程制药公司提供，批号：CA1601015R； 临床分离株：临床分离鲍曼不动杆菌200株，耐喹诺酮大肠埃希菌、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐甲氧西林的葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,，MRSA）各1株。菌种来源：菌株均为2016年6 月至2019年4月在四川成都地区收集的临床分离致病菌。在收集单位经VITEK-60自动微生物鉴定仪鉴定。每株细菌在实验前经琼脂平板划单菌落分纯，37℃隔夜新鲜培养的菌体适当稀释用于实验。动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22 g，购自成都达硕实验动物有限公司（SPF级）。饲养条件：25℃，湿度60%。饲养条件为SPF级，研究过程遵从实验动物饲养管理和使用指南。小鼠由成都达硕生物科技有限公司提供，生产设施许可证：SCXK（川）2008-24。

1.2 实验方法

1.2.1 体外细菌MIC测定[4，5]

将平皿上的单个细菌接种至液体培养基，24 h后，吸取适量该菌液用麦氏比浊管测定浓度，调整浓度至2×107CFU•mL-1，作为工作菌液，此菌液尽量在15 min内接种完毕。配制药物：取可利霉素0.0205g，加无水乙醇和吐温80各600 μL，加入LB培养基2.8 mL，得5.12 mg•mL-1药物原液。其它药物根据预试验取不同浓度对倍稀释。细菌接种：1-13号管为含药培养基，每管的接种菌液量为5μL，故最终每管中约含接种菌量105 CFU•mL-1，第14、15号离心管内只加入LB培养基2 mL，第14号离心管为不含药物的空白对照。第15号离心管为不含药物和细菌的纯培养基对照管。所有培养管置恒温箱中于35-37℃培养18 h后观察结果。以不生长细菌的培养管为该细菌的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。实验方法和结果判读参考美国临床实验室标准化研究协会(Clinical and laboratory standards institute, CLSI) M100-S25标准。药物浓度小于2--8 mg•mL-1，大于16--32 mg•mL-1为耐药。

1.2.2 体内ED50测定[4]

预试实验，找出引起小鼠100% 死亡的最低菌量：将平皿上的细菌接种至液体培养基，小鼠分为若干组，每组5只，雌雄兼用菌液稀释至不同浓度，腹腔注射，每只0.5 mL观察7 d，记录死亡数。用1倍最大致死量（Maximum lethal dose，MLD）菌量感染小鼠1 h后，不同浓度药物灌胃，给药体积0.2 mL•(10g)-1，观察24 h，记录死亡数。正式实验：设计体内治疗保护实验的给药剂量，小鼠分为若干组，每组10只，雌雄兼用。用1 MLD菌量感染小鼠1 h后，根据预实验确定的药物剂量，以1:0.7或1:0.8的浓度间距设置组别，给药体积0.2 mL•(10g)-1；观察14天，记录小鼠死亡数。根据DAS ver1.0软件BLIESS法计算ED50值。

2 结果

2.1 可利霉素对临床分离200株鲍曼不动杆菌的MIC

可利霉素在体外对临床分离的200株鲍曼不动杆菌的MIC值很高，根据判断原则，为不敏感，见表1。

表1 可利霉素对临床分离200株鲍曼不动杆菌的MIC值

2.2 可利霉素对临床分离耐药菌的MIC

临床分离的耐药菌，包括耐喹诺酮大肠埃希菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林的金色葡萄球菌对可利霉素的均不敏感，见表2。

表2 可利霉素对临床分离耐药菌的MIC值

2.3 可利霉素作用于小鼠的ED50

在体内对耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌ED50为112.2 mg•kg-1；对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的ED50为153.2 mg•kg-1；初步认为可利霉素对耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌在体内有一定的抗菌作用，见表3。

表3 可利霉素对各耐药菌的ED50结果

3 讨论

可利霉素首次获批适应症：①下呼吸道感染：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌引起的急性气管-支气管炎；②上呼吸道感染：由肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌、卡他莫拉菌以及葡萄球菌引起的急性鼻窦炎。但在实验中我们发现在体外，可利霉素对鲍曼不动杆菌不敏感，但在体内对耐药的鲍曼不动杆菌有较好的作用（ED50较低）。鲍曼不动杆菌[6]属于非苛养菌，生存能力较强，在临床各类标本和医院环境中检出率很高，容易引起院内感染且迅速通过污染的器械和医务人员手等媒介进行传播，甚至引起院内感染暴发。

近年来经过抗菌药物专项整治，抗菌药物合理应用得到逐步改善，但碳青霉烯类抗菌药物使用量持续增加，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌检出率增加，2017年CHINET显示检出率达到接近70%[7]。

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌常在危重患者中检出，极易在患有严重基础疾病、年老、抵抗力低下住院患者的呼吸道、烧伤创面、皮肤、口腔及泌尿道等部位定植，可引起包括呼吸系统、泌尿系统、血流系统等几乎所有系统的感染，死亡率可以达到50%以上[8]。

耐药的鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物的敏感率均＜30%，仅对多粘菌素和替加环素较为敏感，为此，寻找对泛耐药鲍曼不动杆菌有效的抗菌药物有十分重要的临床意义。尽管我们的研究还未找到可利霉素在体内对鲍曼不动杆菌有效，而在体外几乎没有作用的原因。我们相信，进一步的研究，终将解决这一问题。

近期的研究发现，可利霉素不仅对细菌有杀灭作用， Haiyan Yan等人[9]的研究认为可利霉素对COVID－19的RNA复制有抑制作用，在对200个现有的临床使用药物进行抗COVID－19体外筛选，发现可利霉素的抗冠状病毒作用最强。刘少华等人报道，在2020年武汉新冠流行的时候，可利霉素单用或联合抗病毒药物治疗的2例新冠肺炎患者的发热、咳嗽、乏力等临床不适症状明显缓解，肺部CT显示感染较前明显改善，2次新型冠状病毒RNA检测转阴，临床治愈并顺利出院。 Si-yuan Liang[10]报道，可利霉素能够在体内和体外抑制口腔鳞状细胞癌的生长，其机制可能与调节PI3K/AKT/mTOR and MAPK通路有关。

我们相信，随着可利霉素的临床使用和研究更加广泛，可利霉素新的临床适应症将会有更多的拓展。