105例皮肌炎/多发性肌炎/肿瘤相关性肌炎临床特征和外周血淋巴细胞亚群特点

张盼娣，李 芳

特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathy，IIMs)是一组以骨骼肌和皮肤慢性炎症为特征的易质性、自身免疫性疾病，伴有近端对称性肌无力、血清肌酶升高以及特定的皮肤病变和肌肉外表现[1-2]，包括皮肌炎(dermatomyositis，DM)、多发性肌炎(polymyositis，PM)、包涵体肌炎(inclusion body myositis，IBM)、非特异性肌炎(nonspecific myositis，NSM)和免疫介导的坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)等。其中，伴有肿瘤的肌炎常被称为肿瘤相关性肌炎(cancer associated myositis，CAM)，通常定义为在诊断肌炎前后3年内发生肿瘤的病人[3]，以DM、PM多发。目前IIMs的致病机制尚未明确，多数认为是遗传易感个体在感染与非感染因素诱导下由免疫介导的疾病。DM通常被认为是CD4+T细胞驱动的疾病，PM可能为CD8+T细胞介导的自身免疫过程[4]，而CAM大多数被认为具有副肿瘤性质[5]。研究发现IIMs病人的肌肉组织有免疫细胞浸润和促炎细胞因子的表达，表明免疫失衡在IIMs的发病中起重要作用。本研究收集105例DM、PM、CAM病人的一般信息、临床及实验室等资料，分析3组病人的临床特征与外周血淋巴细胞亚群等实验室相关指标，明确疾病发生可能参与的免疫细胞，探讨潜在的致病机制，以利于临床早期诊治。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年12月—2019年6月就诊于山西医科大学第二医院风湿免疫科的住院病人105例为病例组，均符合1975年Bohan/Peter提出的诊断标准。其中，DM病人56例，男21例，女35例；年龄26～78(49.71±13.12)岁；病程6.00(2.00，24.00)个月；PM病人24例，男11例，女13例；年龄31～76(48.17±12.21)岁；病程30.00(2.00，93.00)个月；CAM病人25例，男9例，女16例；年龄28～76(59.44±8.49)岁；病程7.50(2.00，51.00)个月。所有病人临床及实验室资料完整。排除标准：合并各种急慢性感染、甲状腺功能减退或伴其他传染性疾病者；重叠其他风湿免疫系统疾病者。同期选取我院体检中心的健康体检者103名为健康对照组，男62名，女41名，年龄20～78(45.81±13.41)岁，无风湿免疫病史及家族史。本研究通过山西医科大学第二医院伦理委员会批准，所有病人均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集 收集所有病人的一般资料(性别、年龄、病程)；临床特征(肌痛、肌无力、肺间质病变、关节痛、雷诺现象)及自身抗体(抗ANA抗体、抗Jo-1抗体、抗Mi-2抗体、抗SRP抗体、抗Ro-52抗体)；实验室资料[红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)]。其中，ESR采用魏氏法检测，CRP、ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH采用全自动生化分析仪检测。

1.2.2 CD4+T淋巴细胞亚群的测定 ①Th1、Th2、Th17细胞培养与标记：取80 μL抗凝血分别加入刺激剂10 μL PMA工作液(终浓度30 ng/mL)、10 μL Ionomycin工作液(终浓度750 ng/mL)和1 μL GolgiStop，37 ℃二氧化碳(CO2)培养箱刺激5 h。将细胞分成两管，A管和B管均加入抗人CD4-FITC，室温避光孵育30 min后，各管分别加入新鲜配制的Fixation/Permeabilization液1 mL涡旋混匀，4 ℃避光孵育30 min后，A管加入白细胞介素(IL)-4-PE和γ干扰素(IFN-γ)-抗原递呈细胞(APC)，B管加入抗人IL-17-PE，室温避光孵育30 min后，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，上机检测。②调节性T细胞(Treg细胞)标记：取80 μL抗凝血加入CD4-FITC和CD25-APC，室温避光孵育30 min后，各管分别加入新鲜配制的Fixation/Permeabilization液1 mL涡旋混匀，4 ℃避光孵育30 min后，加入抗人叉头蛋白P3(FOXP3)抗体，室温避光孵育30 min后，PBS洗涤后，上机检测。③流式细胞仪测定：24 h内上流式细胞仪(Calibur，BD，USA)测定分析结果。根据前向角散射光(FSC)对侧向角散色光(SSC)的散点图对淋巴细胞设门区分淋巴细胞，以CD4对SSC设门区分Th细胞(CD4+)，取门内1×104个细胞，以CellQuest软件获取、分析相对百分数。

2 结 果

2.1 各组一般资料比较 CAM组发病年龄高于DM组、PM组及健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；各组性别、病程比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组一般资料比较

2.2 3组病人临床特点及自身抗体比较 3组病人肌痛、肌无力、关节痛、抗ANA抗体、抗Mi-2抗体、抗SRP抗体及抗Ro-52抗体比较差异均无统计学意义(P>0.05)。CAM组肺间质病变、雷诺现象及抗Jo-1抗体阳性发生率低于DM组、PM组(P<0.05)；DM组肺间质病变发生率高于PM组(P<0.05)，而雷诺现象、抗Jo-1抗体阳性发生率与PM组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2、表3。

表2 3组病人临床特点比较 单位：例(%)

表3 3组病人自身抗体比较 单位：例(%)

2.3 实验室指标比较

2.3.1 3组病人炎性指标及心肌酶谱比较 CAM组ESR水平明显高于DM组、PM组(P<0.05)，而DM组、PM组ESR比较差异无统计学意义(P>0.05)。3组CRP、ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4、表5。

表4 3组病人外周血实验室指标比较 [ M(Q1，Q3)]

表5 3组病人心肌酶谱比较 [ M(Q1，Q3)] 单位：U/L

2.3.2 各组外周血淋巴细胞亚群比较 与健康对照组比较，DM组、PM组、CAM组外周血T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助性T淋巴细胞(Th)1、Th17及调节性T细胞(Treg细胞)计数均明显减少(P<0.05)，外周血B细胞、Th2细胞计数及Th17/Treg差异均无统计学意义(P>0.05)。CAM组外周血NK细胞、Treg细胞计数明显低于DM组、PM组(P<0.05)。详见表6、表7。

表6 各组外周血淋巴细胞亚群水平比较 [ M(Q1，Q3)] 单位：个/μL

表7 各组外周血CD4+T淋巴细胞亚群水平比较 [ M(Q1，Q3)]

2.3.3 3组细胞因子水平比较 DM组、PM组、CAM组外周血IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。CAM组外周血IFN-γ水平明显低于DM组、PM组(P<0.05)，但DM组、PM组IFN-γ水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表8。

表8 3组细胞因子水平比较 [ M(Q1，Q3)] 单位：pg/mL

3 讨 论

IIMs是一组全身性自身免疫性疾病，其特征为骨骼肌的慢性炎症，以DM和PM最为常见。传统观点认为自身免疫性疾病的发病机制是由于效应T细胞的过度激活引起的，近年来，由Treg细胞数量和功能失衡引起的免疫耐受被认为是自身免疫性疾病的关键起源。且目前已有大量研究证实免疫平衡的破坏是IIMs发病的主要原因[6-8]。因此，分析外周血淋巴细胞亚群有助于了解病人机体的免疫功能，为免疫治疗提供依据。

本研究结果显示，DM、PM、CAM病人外周血淋巴细胞各亚群如T淋巴细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th1、Th17及Treg细胞绝对计数均低于健康对照组，表明外周血淋巴细胞亚群可能参与DM、PM、CAM的发病过程，提高外周血淋巴细胞水平有助于改善病人免疫功能，与孙何花[9]的研究结果一致。本研究还发现，相较DM、PM病人，CAM病人外周血Th17细胞水平基本相近，而Treg细胞绝对计数却明显减少，提示Treg细胞在CAM微环境中对肿瘤的发展可能起抑制作用，其作用机制涉及Foxp3+Treg细胞可重编程分化为效应性T细胞，从而使抗肿瘤免疫表达增强[10]，或通过抑制炎症驱动恶性转化的过程以保护机体免受恶性肿瘤的侵害[11]。因此，本研究得出Treg耗竭治疗策略可能不适用于CAM，相反，升高Treg细胞水平的靶向免疫治疗或许可延缓CAM进展，有待进一步深入研究。

干扰素(interferon，IFN)是一组多效性细胞因子，可激活树突状细胞和淋巴细胞并调节细胞的分化、增殖与凋亡，在机体免疫应答、宿主抵抗病毒细菌感染以及肿瘤监测中发挥重要作用[12]。IFN-γ是Ⅱ型IFN的唯一成员，其受体由IFN-γR1和IFN-γR2亚基组成[13-14]，主要来源于NK细胞、CD4-Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞[15]，可调节多种免疫细胞类型的分化和功能。本研究发现，与DM、PM病人比较，CAM病人外周血IFN-γ水平明显降低，提示在免疫失衡基础上，IFN-γ水平降低可能参与CAM的发生，与Huffaker等[16-17]研究结果肿瘤微环境中IFN-γ的表达减慢了肿瘤的生长相一致。其机制可能为通过抑制肿瘤细胞周期，诱导肿瘤缺血以及激活APC和效应细胞从而抑制肿瘤生长[18]，表明IFN-γ在监测和消除肿瘤细胞中起重要作用。那么干扰IFN-γ的表达水平或许可减少CAM的发生，为其治疗提供新思路。

本研究中，105例病人发病年龄以CAM病人较高，表明年龄较大可能是CAM发生的危险因素，与Lu等[19-20]研究结果相似。CK对于IIMs病人而言敏感性高，特异性差，其升高的程度与肌肉损伤程度平行，但也有少数病人活动期CK水平可以正常[21]。本研究中，CAM病人雷诺现象、抗Jo-1抗体阳性发生率低于DM、PM病人，而ESR明显高于DM、PM病人，表明雷诺现象、抗Jo-1抗体阳性是CAM发生的保护因素，而ESR增快可增加其发生风险。此外，本研究还发现3组病人关节痛、肌痛症状及血清CK水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，可能与样本量及病情活动有关。间质性肺疾病被认为是IIMs最常见的系统性并发症之一[22]，与预后较差和死亡率增加相关[23-24]。Hallowell等[22]报道PM、DM合并间质性肺疾病的病例数占19.9%～78.0%。本研究结果显示，DM、PM、CAM合并间质性肺疾病的百分比依次为66.07%、41.67%、16.00%，以CAM合并间质性肺疾病最少，表明CAM病人与伴有间质性肺疾病的减少相关，这与Zhang等[25]的Meta分析发现恶性肿瘤与合并间质性肺疾病的风险降低一致。有研究发现促炎细胞因子(如IL-6)可刺激中性粒细胞和淋巴细胞，进而引起肺泡上皮细胞损伤[26]。DM病人较易合并间质性肺疾病，可能与其外周血中IL-6水平的较高表达有关。本研究中所有伴发间质性肺疾病病人均采用高分辨率CT(HRCT)诊断，既往研究证实肺活检组织学改变与HRCT的检查结果一致[27]，且HRCT诊断具有高特异性，高达90%[28]，故早期DM病人应更加注重HRCT检查以明确有无间质性肺疾病的发生。

综上所述，DM、PM、CAM病人外周血淋巴细胞亚群存在免疫失衡，Treg细胞和IFN-γ的水平降低可能参与CAM的发生，提示靶向调节外周血淋巴细胞和细胞因子水平有助于改善病人免疫功能，而预测CAM发生的风险因素将有助于提早干预，有望为DM、PM、CAM致病机制的进一步探究及提高诊治率提供新思路。