急性缺血性脑卒中病人血浆miR-141、PAPP-A水平与疾病严重程度和短期转归的关系

刘晓琳，朱艳玲，郭丽莎，郝文莉

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)是最常见的脑卒中类型，发病率呈逐年上升的趋势，占我国脑卒中的69.6%～70.8%[1]。临床对急性脑卒中病人转归结局的判断主要依据影像学结果和临床经验，而对血糖等血液生化指标外的生物标志物研究较少。microRNAs(miRNAs)具有重要的生物学功能，参与生长发育、细胞增殖、细胞分化等，目前已发现多种miRNAs与AIS病人预后有关[2]。有研究表明，miR-141在胶质瘤癌组织及细胞系中高表达，与肿瘤大小、分化程度及是否转移相关[3]。妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)作为金属蛋白锌家族中的成员之一，可减少纤维蛋白的溶解，促进凝血过程，进一步使内皮细胞外基质重塑，加速斑块的不稳定[4]。研究表明，PAPP-A在AIS病人血浆中高表达，可作为脑卒中的预测因子及预后指标[5]。但miR-141与PAPP-A在AIS病人血浆中的表达及与预后的关系尚不清楚。本研究对miR-141、PAPP-A在AIS病人血浆的表达情况进行检测，并探讨二者与AIS病人脑卒中严重程度和短期转归的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年12月—2019年12月在我院神经内科住院的AIS病人183例，其中，男99例，女84例；年龄50～79(62.30±9.20)岁。纳入标准：①符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2018)中诊断标准[1]；②经1.5T或3.0T磁共振成像(MRI)诊断证实；③病人临床资料完整。排除标准：①伴有严重心、肝、肾功能异常或恶性肿瘤者；②入院前1个月内有严重感染或近期(发病前2周内)有手术和创伤史；③出血性脑血管病或短暂性脑缺血发作；④接受静脉溶栓以及血管内治疗或免疫抑制剂治疗等；⑤临床资料不全者。依据美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)[6-7]评分，将病人分为轻度卒中组(NIHSS评分≤8分，115例)及中重度卒中组(NIHSS评分>8分，68例)。脑卒中后14 d采用改良Rankin量表(Modified Rankin Scale，mRS)[8]评分标准进行评分，mRS 评分0～2分为转归良好，mRS评分3～5分或死亡为转归不良。

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒购自北京天根生化有限公司；实时荧光定量试剂盒购自大连TAKARA公司；反转录试剂盒购自日本TOYOBO公司，miR-141及U6引物，由上海生工生物公司设计与合成；实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪购自美国Bio-Rad公司；PAPP-A检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 血浆样品：采集AIS病人空腹静脉血5 mL，装入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)抗凝管，常温3 000×g离心10 min后收集血浆，-80 ℃保存备用。

1.3.2 qRT-PCR检测血浆中miR-141的表达 按照RNA提取试剂盒方法、步骤抽提血浆中的总RNA，按照反转录试剂盒(日本 TOYOBO)说明书进行反转录合成cDNA。miR-141基因和U6基因序列设计引物，由上海生物工程公司合成，引物序列见表1，反应总体系20 μL。反应条件：95 ℃、90 s，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、15 s，38个循环。每个样品设置3个复孔。反应结束后，以U6作为内参，采用2-∆∆CT分析法计算miR-141表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆PAPP-A水平 采用ELISA法检测血浆PAPP-A水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 轻度卒中组与中重度卒中组临床资料比较 轻度卒中组高血压、冠心病、空腹血糖、C反应蛋白、miR-141、PAPP-A水平与中重度卒中组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 轻度卒中组与中重度卒中组临床资料比较

2.2 Logistic回归分析AIS严重程度的影响因素 将单因素分析中差异有统计学意义的变量作为自变量，脑卒中严重程度作为因变量进行Logistic回归分析，结果显示，miR-141、PAPP-A、高血压、冠心病、空腹血糖和C反应蛋白是脑卒中严重程度的影响因素(P<0.05)。详见表3。

表3 AIS严重程度影响因素的Logistic回归分析

2.3 转归良好组与转归不良组临床资料比较 转归良好组糖尿病、冠心病、收缩压、空腹血糖、C反应蛋白、miR-141、PAPP-A水平及基线NIHSS评分与转归不良组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 转归良好组与转归不良组临床资料比较

2.4 Logistic回归分析AIS病人短期转归的影响因素 将单因素分析中差异有统计学意义的变量作为自变量，病人短期转归情况作为因变量进行Logistic回归分析，结果显示，miR-141、PAPP-A、糖尿病、冠心病、空腹血糖、C反应蛋白和基线NIHSS评分是短期转归不良的影响因素(P<0.05)。详见表5。

表5 短期转归不良危险因素的Logistic回归分析

3 讨 论

缺血性脑卒中为神经内科常见疾病，是中老年人最常见的脑血管疾病之一，临床表现以神经功能缺损为主，具有高发率、高死亡率、高致残率和高复发率等特点[9-10]。因此，寻找影响疾病严重程度并识别预后不良的危险因素，对脑卒中的预防和治疗尤为重要。

miRNA与脑组织发育、分化、生理功能及病变等密切相关，可参与炎症、促血管形成过程或抑制内皮细胞增殖来发挥抗血管形成等多种与缺血性脑卒中相关的作用。Aconetti等[11]研究表明miR-23b在颈动脉球囊血管损伤大鼠中下调表达，过表达miR-23b可减少内膜增生，调节血管损伤后血管平滑肌细胞的表型转换。侯丽淳等[12]研究表明缺血性脑卒中病人血浆中miRNA-145表达水平升高、miRNA-146a表达水平降低，与缺血性脑卒中的发生和发展密切相关。刘大全等[13]研究表明miR-141能通过增强血管内皮细胞的增殖和迁移能力，进而促进血管新生。Liu等[14]利用缺氧处理大鼠肠系膜上动脉和血管平滑肌细胞，结果发现miR-141可参与缺氧和出血后血管反应活性的调控。本研究显示，与轻度卒中组比较，中重度卒中组血浆miR-141表达水平明显降低，Logistic回归分析显示miR-141与AIS严重程度有关，miR-141水平降低是转归不良的独立危险因素，推测低水平miR-141可能对血管新生的促进作用较弱，不利于病人转归。

PAPP-A是金属蛋白锌家族中的成员之一，在炎性反应过程中可导致斑块破裂，引发脑梗死，其水平升高可反映动脉粥样硬化斑块的不稳定性[10，15]。Wang等[16]研究表明PAPP-A在缺血性脑卒中病人血浆高表达，与缺血性脑卒中的严重程度或预后相关。生晓娜等[17]研究表明在急性缺血性脑血管病病人中，颈动脉粥样硬化斑块形成者血浆PAPP-A水平升高，与急性缺血性脑血管病病人颈动脉粥样硬化的发生和进展有关。Zhang等[18]研究表明，miR141可通过作用于PAPP-A，抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的动脉粥样硬化血管平滑肌细胞的增殖。本研究结果显示，中重度卒中组血浆PAPP-A水平明显高于轻度卒中组，Logistic回归分析提示，血浆PAPP-A水平与AIS严重程度相关，推测PAPP-A水平高可能影响血管流通性，进而影响AIS严重程度。转归不良组PAPP-A水平明显高于转归良好组，PAPP-A水平增高是转归不良的独立危险因素，提示PAPP-A可能作为AIS病人潜在预后标志物。

综上所述，AIS病人血浆中miR-141低表达、PAPP-A高表达，二者与脑卒中严重程度和短期转归有关，可能作为AIS病人潜在的预后标志物。但由于本研究样本量有限，仍需扩大样本量做进一步研究。