糖基化改性玉米醇溶蛋白膜的性能及硬胶囊体外释放分析

2021-10-12张慧君宋君宇贺小惠徐雪晗辛德慧

农业工程学报 2021年14期

李萍，张慧君※，郭浩，宋君宇，贺小惠，徐雪晗，赵红，辛德慧

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省果蔬杂粮饮品工程技术研究中心，齐齐哈尔 161006；2.上海夺汇网络技术中心，上海 200082；3.齐齐哈尔大学轻工与纺织学院，齐齐哈尔 161006；4.上海纽贝滋营养乳品有限公司，上海 201605）

0 引言

硬胶囊壳（Capsule shell）是将明胶、淀粉或纤维素及其衍生物等原料，添加色素、遮光剂等辅料混合后制备的一种空心外壳，可填充药物、活性成分或风味物质等固体粉末或颗粒[1]。目前市场上常见的胶囊是动物来源的明胶胶囊，由于明胶吸湿性强，胶囊存在吸水软化、失水硬化，对湿、氧敏感药物保护作用差等缺陷，因此对贮存环境要求较高。为了克服上述缺陷，人们逐步开发植物来源的淀粉或纤维素及其衍生物来制备胶囊[2-4]，然而在制备胶囊时具有脱模易破裂、阻湿、阻氧性能差等缺陷。另外无论明胶胶囊还是淀粉或纤维素及其衍生物制备的植物胶囊，它们都属于胃溶性胶囊[5]，摄入胃中后，胶囊壳发生崩解释放内容物，强酸性的胃液易引起某些药物或活性物质功能下降[6]。目前市场上的肠溶胶囊大多为明胶胶囊外包肠溶衣制成，它主要是由邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基丙基纤维素和丙烯酸树脂类物质制成。对于倡导绿色安全的今天，寻找对人体无副作用安全且机械性强、阻隔性能好的植物肠溶性胶囊壁材逐渐成为研究热点。

玉米醇溶蛋白（zein）来自于玉米淀粉湿法加工的副产物，每吨玉米加工成玉米淀粉，大约产生5%左右的玉米蛋白粉，玉米蛋白粉中约含60%左右的玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白分子中极性氨基酸较少，富含硫氨基酸和疏水氨基酸较多，其分子间以较强的氢键、二硫键和疏水键相连，使其形成致密的网状结构，这种特殊的氨基酸组成使其具有良好的成膜特性[7-8]，其膜具有一定的阻湿、阻氧以及肠溶性[9]。然而zein分子中缺乏带电的酸性、碱性和极性氨基酸，使其存在成膜脆弱、拉伸强度低和机械性能差等缺点[10]。因此不能满足作为包装材料的力学强度和产品货架期的要求，无法商业化生产[11-12]。

蛋白质分子的适度改性可强化分子间的作用力，促使其形成更致密均匀的网络结构进而改善膜的性能[13]，进一步拓展其应用领域，满足生产和发展需求[14]。糖基化改性是一种有效的天然蛋白质改性方法[15]，具有方法简便，无化学残留等特点。干热糖基化法是由日本 Kato等[16]首先提出，它是一种基于固相体系的反应方法，多用于制备蛋白质-多糖共价复合物，其反应条件较为苛刻，且反应时间较长，有的甚至达到几周[17]。湿热糖基化法是在液相体系中加热制备单糖、双糖或低聚糖-蛋白质共价复合物[18]。该反应存在着改性程度深、速度快、反应条件简单、时间短和利于工业化操作等特点。陈又铭等[12]研究发现经菊粉糖基化改性能够有效改善原玉米醇溶蛋白膜的阻水性，即在糖基化反应的过程中形成的接枝产物中引入了一定量的多聚果糖将玉米醇溶蛋白中所含的亲水氨基酸包裹，使膜的结构更加紧密，有效地阻止其与水蒸汽接触。湿热法尤其适合单糖或低聚糖等小分子还原性糖对蛋白质进行改性，可有效提高膜的抗拉强度，具有反应条件温和，易于实现的优点[8]。张慧君等[19]采用麦芽糖浆对玉米醇溶蛋白进行湿热法糖基化改性，制备的 zein-MS膜的抗拉强度有所提高，抗拉强度（Tensile Strength，TS）增加为9.22 MPa，说明糖基化改性过程中，玉米醇溶蛋白与麦芽糖浆（Maltose Syrup，MS）发生了糖基化反应，使分子的羟基数量增加，改变了玉米醇溶蛋白的空间结构，成膜后结合的水分也增多，从而减少分子间的作用力，增加了分子链的流动性，使膜的柔韧性增强，膜抗拉强度得到提高。因此糖基化改性后的产物制备胶囊壳机械性能有所提高，同时作为与外界环境隔离的介质，具有可阻止水蒸气、氧气、二氧化碳以及其他溶剂蒸气透过薄膜的能力。

薄膜阻隔能力大小不仅关系到包装内容物的呼吸强度、油脂类食品的酸败、对延长产品保质期以及内容物的释放等有着重要的意义[20-24]，而且可以作为新的功能性材料应用于食品工业、生物材料及医药科学等领域[25]。葡萄糖（Glucose，Glu）作为一种食品常用的甜味剂，价格低廉，来源广泛，而且葡萄糖分子量较小，葡萄糖与玉米醇溶蛋白糖基化反应更剧烈，更易发生糖基化反应，得到的接枝产物膜更致密。本研究采用葡萄糖对玉米醇溶蛋白进行湿法糖基化改性，在前期解决纯玉米醇溶蛋白制成膜（zein膜）机械性能差，脱模成型率低的基础上，拟考察糖基化改性对改善接枝产物（zein-glu）制备成膜后的阻氧、阻水、阻油性能的影响，探索其作为胶囊壳材料对填充内容物的保护作用，考察溶胀型肠溶性胶囊在模拟胃肠液中的释放规律，为进一步制备肠溶胶囊壳并扩大玉米醇溶蛋白的应用范围提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米蛋白粉（Corn Gluten Meal，CGM），黑龙江省镜泊湖农业开发股份有限公司；葡萄糖，天津市科密欧化学试剂开发中心；α-淀粉酶，北京奥博星生物技术有限公司；无水乙醇，天津市东丽区天大化学试剂厂，分析纯；罗丹明B，生工生物工程（上海）股份有限公司；胃蛋白酶，酶活≥1 200 U/g，国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶，酶活≥1 250 U/mg，丹麦诺维信集团；磷酸二氢钾，辽宁泉瑞试剂有限公司；保鲜膜，PE聚乙烯，GB/T 10457，脱普日用化学品（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

万能电子试验机，济南普创机电有限公司；测厚计，江都市天发试验机械厂；电子分析天平，美国Denver丹佛仪器公司；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；粉碎机，德国IKA公司；超声波信号发生器WSL-1000D，南京顺流仪器有限公司；真空冷冻干燥机LYOQUEST-85，德国 Marin Christ公司；超低温冰箱Thermo702，赛默飞世尔科技有限公司；水蒸气透过率测定仪 W301，广州标际包装设备有限公司；酶标仪，Molecular Devices公司。

1.3 研究方法

1.3.1 原料预处理

参照文献[7]，取 50 g玉米蛋白粉，于 95℃下加入0.5 mLα-淀粉酶除去淀粉，以料液比 1∶10加入丙酮，在50 ℃下对样品进行脱色，脱色后的样品用体积分数为70%的乙醇溶液浸提2 h，5 000 r/min离心15 min，取上清液，匀速倒入5倍浸提液体积的0℃冰水，搅拌，滴加1 mol/L NaOH溶液调pH值为6左右，出现白色沉淀，经5 000 r/min离心3 min，得到沉淀，水洗3次，在-50 ℃，真空度10 Pa下冷冻干燥24 h，得到zein样品，备用。

1.3.2 糖基化改性及膜的制备

参照文献[8]，用70%的乙醇溶液溶解玉米醇溶蛋白，配制 80 g/L的玉米醇溶蛋白溶液，按质量比 10∶1（mzein/mglu）加入葡萄糖，450 W的超声波功率处理5 min，70℃水浴30 min进行糖基化反应，后4℃冷却结束反应，将冷却后反应产物置于 60℃烘箱烘干成膜，取出置于30 ℃，相对湿度（Relative Humidity，RH）为43%干燥器内平衡24 h，备用。

1.3.3 明胶膜的制备

明胶膜的制备：取适量明胶按一定比例溶解，于60 ℃的条件下烘干成膜，制备成厚度为0.2 mm左右的薄膜。平衡24 h（RH 43%，30℃）后，进行测定。

1.3.4 膜抗拉强度（Tensile Strength，TS）的测定

由于本研究改性目的用于制备硬胶囊，其形状为帽状 2节式圆柱体，为方便探讨硬胶囊的膜性能，将膜制备成平面膜，进行性能测定。

将制备的蛋白膜裁剪成长为85 mm，宽为15 mm的矩形长条，使用万能电子试验机测定，其夹距设定为45 mm，拉伸速度为100 mm/min。计算如下式

式中 TS为抗拉强度，MPa；F为最大拉力，N；L为样品膜的厚度，mm（采用测厚仪对样品膜的4个边缘处和中心处的附近分别取点重复 3次，求取平均值为该膜厚度）；W为膜样品的宽度，mm。

1.3.5 吸水性和阻水性的测定

吸水率的测定：参照张敏等[26]的方法，并略有改动。称取一定质量的zein膜和zein-glu膜（W1），放入（23 ±0.5）℃蒸馏水中分别浸泡12、24、36、48、60、72 h后取出，快速用软布擦干后并放入称量瓶中，称得吸水后质量（W2）。吸水率计算公式如下

式中C为吸水率，%；W1为薄膜原质量，g；W2为吸水后的质量，g。

阻水性的测定：首先将干燥剂烘干至恒重，然后将其放入水蒸气透过率测定仪的测试腔中，将剪成好的zein膜和zein-glu膜置于放有30 g蒸馏水的透湿杯中并使用密封脂密封。在25 ℃下测试并记录图谱，并按照公式（3）计算水蒸气透过系数。

式中 WVP 为水蒸气透过系数，10-8g·m/(m2·d·Pa)；T为膜厚，m；ΔP为水蒸气压差，Pa；WVTR为水蒸气透过率，g/(m2·d)。

1.3.6 阻氧性测定

按照 GB 5009.227—2016对油脂的过氧化值进行测定[27]。准确称取20.00 g植物油，分别用zein膜、zein-glu膜和保鲜膜覆盖密封后在培养箱（温度25 ℃）里陈化12 d（288 h）。

1.3.7 阻油性测定

在试管中加入1 mL的植物油，分别用保鲜膜、zein膜和zein-glu膜封口，倒扣于滤纸上，将其放入相对湿度50%的恒湿箱中，隔3 d称量一次。在相同条件下进行空白试验。阻油性计算公式如下：

式中P0为透油系数，g·mm/cm2·d；ΔW为滤纸质量前后的变化，g；FT为膜厚度，mm；S为膜面积，m2；t为放置时间，d。

1.3.8 胶囊壳的制备

采用70%乙醇溶液溶解zein-glu，制成8%左右的溶胶，70 ℃搅拌30 min制备成胶囊溶胶，在1#胶囊壳模具蘸胶、干燥后脱模等到胶囊壳。

1.3.9 胶囊壳的药物释放

人工胃液的制备：准确量取16.4 mL 浓度为10%的稀盐酸放入800 mL水中，另称量10.0 g胃蛋白酶，使两者充分混合后得到澄清的胃液，将得到的澄清的胃液定容至1 L。

人工肠液的制备：按照《中华人民共和国药典（第四部）》（2015年版）的要求[28]，配制pH值为6.8的磷酸盐缓冲液即人工肠液。称量6.8 g KH2PO4后放入500 mL水中，调节pH值为6.8，另称量10 g胰酶，使两者混合后得到澄清的肠液，定容至1 L。

释放率的测定：本试验按照《中华人民共和国药典（第四部）》的要求，采用小杯法测定释放率，并在此测定方法上略微改动。依据实际的实验条件进行略微改动，具体操作如下：准确称取小分子罗丹明B 0.001 0 g装填至zein-glu硬胶囊中，放置于50 mL离心管中并加入30 mL的人工胃液后放入摇床（37 ℃、150 r/min）。在人工胃液中停留0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后转入到人工肠液内，分别考察罗丹明B在人工肠液中硬胶囊的释放情况。

测定时，每30 min取样5 mL，并向离心管内补充5 mL的人工肠液，在554 nm下测定吸光度，根据吸光度计算罗丹明B在硬胶囊中的释放率，计算公式如下

式中R为释放率，%；Cn为第n次取样时，测定人工胃（肠）液中的药物浓度，mg/mL；V为试验所取人工胃（肠）液的体积，mL；Cn-1为第n-1次取样时，测定人工胃（肠）液中的药物浓度，mg/mL；Vi为每次取样的体积，mL；w为称取药物的质量，mg。

1.4 数据处理

所有试验均重复 3次，数据采用平均数±标准差（±S）表示。数据处理采用Excel软件，统计分析采用SPSS 19.0软件，并进行邓肯多重比较。

2 结果与分析

2.1 膜机械性能分析

膜的机械性能通常作为评价包装材料在加工和应用过程中抵抗外力作用后仍保持膜完整性的能力[29]。由于《中华人民共和国药典》中对胶囊的检测指标主要以明胶（gelatin）胶囊为依据，故本文对制备出的玉米醇溶蛋白膜（zein-film）、葡萄糖改性玉米醇溶蛋白膜（zein-glu film）膜与相同厚度的明胶膜（gelatin film）进行了抗拉强度的比较，结果如图1所示。

由图1可知，zein膜抗拉强度最低，仅为4.67 MPa，通过糖基化改性，得到zein-glu膜的抗拉强度与zein膜相比较高，达到了34.06 MPa，是改性前的8.5倍左右，一方面说明利用糖基化改性的方法可以提高蛋白膜的机械性能；另一方面证明改性后zein膜的机械性能与gelatin膜相比有很大的提高。在糖基化改性过程中，玉米醇溶蛋白与葡萄糖发生糖基化反应，使改性后玉米醇溶蛋白的空间结构也发生变化，即蛋白质分子发生一定程度的伸展，促使蛋白分子成膜时疏水基团和巯基交联而富有柔韧性，从而增加了膜的机械性能[30]。

2.2 膜吸水性与阻水性分析

膜吸水性能和阻水性能的大小直接决定产品的适用范围，也决定胶囊产品的质量[31]。本文对 zein膜与zein-glu膜分别进行吸水率和水蒸气透过率的测定，结果分别用来表示两种蛋白膜的吸水性和阻水性，结果如图2所示。

图2 a 为zein膜和zein-glu膜的吸水率随时间变化趋势。结果发现，随着浸泡时间的增加，两种蛋白膜的吸水能力逐渐增加，当膜吸水能力逐渐达到饱和时，吸水量也随之减少，因此吸水率均呈现先增加后降低的趋势，其中zein膜在浸泡60 h的吸水率较高，为45.71%；而zein-glu膜的吸水率与zein膜相比有明显的提高（P＜0.05），在24 h吸水率达到最大，为84.98%。

膜的吸水率与其分子亲水基团、疏水基团的空间排列结构有关。通过糖基化改性，玉米醇溶蛋白引入了含有亲水性羰基葡萄糖，使分子间力减小，增大分子间距离，增加了改性产物对周围环境水分的吸附能力，使膜的吸水率大大增强[19]。

薄膜的阻水性通过水蒸气透过率的大小来体现，该值取决于介质中的渗透性溶解度和扩散速率[32]。图2 b 为zein膜和 zein-glu膜的吸水率随时间变化图，从图中可以看出zein膜和zein-glu膜的水蒸气透过率结果呈现出相同的变化趋势，均随时间的增长而逐渐增加。水蒸气透过率从7 min后缓慢上升直至32 min后逐渐平稳，zein膜的水蒸气透过率在平稳时为 12.01×10-8g·m/(m2·d·Pa)，zein-glu 膜的水蒸气透过率在达到平稳时降至 7.89×10-8g·m/(m2·d·Pa)。

蛋白膜阻湿性能很大程度上依赖于分子内的疏水作用，蛋白质分子由内到外疏水残基增多，亲水残基减少[10]。与zein膜相比，zein-glu膜呈现出较低的水蒸气透过率，由于玉米醇溶蛋白膜的疏水性基团多，亲水性差[33]，改性后糖基化反应中引入的还原糖分子中含有大量的极性基团，zein-glu表面的亲水残基得到暴露，使膜具有高度的亲水性，提高zein-glu膜对水的吸附能力，降低水分在膜中的扩散能力，从而有效地提高了膜的阻湿屏障[34]。解决了传统明胶胶囊对湿敏感的药物保护作用差的缺陷，有效提高胶囊对内容物的保护。

2.3 膜阻氧性与阻油性分析

阻氧性是衡量膜材料性能的一个重要指标。玉米醇溶蛋白膜对O2的阻隔性高，有利于防止食品的氧化变质，例如可延缓包材内容物中的油脂与氧气的迁移和扩散；阻油性能高可延缓油脂的渗透，保证产品质量的稳定[35]。本研究用zein膜和zein-glu膜与市售保鲜膜等进行对比，分别以油脂过氧化值、透油系数的大小来表示膜的阻氧性及阻油性，结果如表1所示。

表1 膜的阻氧阻油性检测结果Table 1 Test result of oxygen and oil resistance of film

市售保鲜膜材质为聚乙烯，这类保鲜膜具有适度的透氧性和透湿度，从而调节被保鲜品周围的氧气和水分的含量，阻隔灰尘，达到延长食品保鲜期的效果。在阻油性试验中发现，无论是覆有保鲜膜的试管，还是覆有zein膜、zein-glu膜以及明胶膜的试管，均未有油渗出，也证明了4种膜具有良好的阻油性能，4种膜的过氧化值：保鲜膜的过氧化值为0.55 g/100 g，zein膜和zein-glu膜的过氧化值分别为0.49 g/100 g和0.43 g/100 g，明胶膜的过氧化值为0.62 g/100 g，以未覆膜的敞口管的过氧化值1.34 g/100 g作对照，说明覆膜有助于防止油脂的过氧化，zein膜和zein-glu膜的过氧化值均低于市售保鲜膜，说明zein膜和zein-glu膜具有良好的阻氧性，且zein-glu膜的阻氧性更好。这是因为玉米醇溶蛋白本身含有大量非极性氨基酸，易于对空气中的氧气分子形成吸附作用，添加葡萄糖进行改性后，可以使分子间紧密相连的氢键、二硫键及疏水键增多，形成了更致密的空间结构，并且通过糖基化改性，葡萄糖与蛋白质多肽链及水分子之间形成的氢键，稀释弱化多肽链之间刚性直接作用，可有效改善蛋白膜的分子结构，使其内部结构更加紧密，因而透气性低，起到了阻氧阻油的作用[7,36]。因此zein-glu膜可作为一种新型的包装材料应用于食品、药品以及包装领域中。

2.4 硬胶囊肠溶性

本研究对载有小分子罗丹明B的硬胶囊做释放曲线，通过数学方法拟合模型及验证，研究硬胶囊的释放行为，建立释放模型。

胃肠道是药物的必经通道，近年来，大量的临床药理的研究发现，食物对口服药物的吸收存在广泛的影响。当口服给药后，通过改变药物在胃肠的转运时间，可影响药物的吸收[37]。而药物在胃部转运时间与食物种类、化学组成和物理性状等都关系[38]。液体食物比固体食物排空快，当进食液体，仅停留5～10 min；糖类（大米、面食等）排空时间约1h左右；蛋白质停留约为2～3 h；脂肪类食物排空则需4～5 h之久。人们在日常生活中大多数进食一些混合食物，所以通常胃完全排空时间需要3 h左右[32]。因此，本文胶囊在胃中研究时间选0～3 h。

2.4.1 小分子罗丹明B在胃中的释放情况

本研究模拟人体胃肠环境，首先考察zein-glu硬胶囊在胃部的释放情况，将载有小分子罗丹明 B的 zein-glu硬胶囊分别在胃中停留0.5～3.0 h，检测其释放情况。

zein-glu硬胶囊在胃中停留0.5～3.0 h后，经紫外检测，均未有吸收，释放率为0，故该载有小分子罗丹明B的葡萄糖改性玉米醇溶蛋白制备的硬胶囊不溶于胃液，其中的内容物罗丹明B在胃中不会释放，说明糖基化改性后的玉米醇溶蛋白胶囊不属于胃溶性胶囊。

2.4.2 小分子药物在肠道中的释放情况

以罗丹明B作为小分子药物研究对象，将载有罗丹明B的硬胶囊分别在胃中停留0.5～3.0 h后转入肠液，考察载有小分子罗丹明B的zein-glu硬胶囊在肠液中的释放情况，结果如图3所示。

当载有小分子罗丹明B的zein-glu硬胶囊在胃液中停留0.5 h后转入肠液，在肠液停留1 h释放率为8.38%，5 h后释放率91.61%，6 h后释放率在99%以上；当在胃液停留3 h后转入肠液，1 h释放率为60.56%，4 h后释放率在 99%以上；说明在相同释药时间内，在胃液中停留时间的长短对硬胶囊内药物的释放率影响较大。如提高硬胶囊在胃中的停留时间，可使小分子罗丹明B在肠液中的释放率明显增加（P＜0.05）。

这说明 zein-glu硬胶囊的释放属于溶胀型而非崩解型，这类硬胶囊在液体中不被溶蚀，但可以吸收大量的液体类物质，使其体积逐渐增大，形状发生变化[39]。试验中小分子罗丹明B在释放过程中，zein-glu硬胶囊进入体内后，首先吸收一部分水分，使其体积不断膨胀，内部分子键不断拉扯而断裂，从而增大了分子间的孔隙，使小分子罗丹明B逐渐释放出来。

由于药物在小肠停留时间为1.5～7.0 h，说明载有小分子内容物的硬胶囊适合饭后服用并可在小肠吸收[40]。

本研究采用回归分析，样本数量为90个，以硬胶囊在肠内停留的时间（x1，h），硬胶囊在胃内停留的时间（x2，h）为2个自变量，y为小分子罗丹明B的释放量（mg）。应用 SPSS软件进行了数据计算分析，得到方程通过 SPSS软件可以得到方差分析的F值，并用卡方检验进行方程的显著性检验。

对方程进行卡方检验，进行假设：原假设线性关系不显著H0∶β0=β1=β0=β2=0，备择假设线性关系显著H1∶β0≠β1≠β0≠β2≠0，结果见表2。H0为小分子药物释放的分布函数F(x)。β0为释放拟合方程中的常数，β1和β2为拟合方程中的系数。

表2 小分子释放方差分析表Table 2 Analysis of variance table of small molecule release

F统计量服从自由度为（2，87）的F分布，给定显著性水平为α=0.05，查表得F0.05（2，87）=3.11，由方差分析得，F值=173.487＞3.11，P值=0，拒绝原假设H0。认为置信水平95%下，回归方程是显著的[41]。

同时，小分子释放模型总体参数（Model Summary）表格中体现出复相关系数r=0.894，决定系数R2=0.800，二者都接近1，这一现象同样能证明回归方程具有显著性。

对方程进行t检验，由SPSS软件输出的coefficients表格中提供了t值，所以对回归系数的检验应用t检验来进行，首先对回归系数检验进行假设：原假设：H0：βj=0，备择假设H1：βj≠0，结果见表3。

由表3可知，β0、β1和β2则分别代表回归方程的常数量和回归系数，t统计量服从自由度为87的t分布，给定显著性水平为α=0.05，查得双侧检验临界值为1.980，回归常数β0的|t0|=3.650＞1.980，拒绝原假设，自变量x1的|t1|=18.180＞1.980，拒绝原假设；x2的|t2|=4.058＞1.980，拒绝原假设；由此得知，给定显著性水平为α=0.05时，β0、β1和β2的P值＜0.05，均通过检验。