基于增强拉曼光谱的苹果中啶虫脒农药残留的无损定量分析

彭彦昆，田文健，郭庆辉，赵鑫龙，乔 鑫

（中国农业大学工学院，国家农产品加工技术装备研发分中心，北京 100083）

0 引 言

随着科学技术的进步以及农业现代化的快速发展，农产品的生产效率不断提高。在提高农作物产量的同时，农药滥用的问题也随之出现。过量施用农药会导致消费者购买的农产品中的农药残留超标，严重威胁了消费者生命健康[1]。又因农药的种类繁多，且残留量十分微小，给检测和监管增加了难度，因此进行农产品中农药残留新检测方法的研究具有十分重要的意义。

目前，农药残留检测方法主要分为传统检测法、生物测定技术和光谱分析技术三大类[2-4]。其中，传统检测法操作难度高，操作时间长且价格较昂贵，对样品具有一定的破坏性，无法大面积推广应用[5-6]。拉曼光谱具有指纹效应，其光谱的谱峰反映了被测物分子的化学键振动与转动信息，在物质检测方面广泛应用。但拉曼光谱受限于较小的拉曼散射截面，信号强度较弱，无法对农作物中的痕量残留提供准确的检测[7]。在粗糙贵金属纳米颗粒之间的局部等离子体共振增强和被测物分子与纳米粒子之间的吸附增强的共同作用下，拉曼信号会获得极大的增强，由此获得的光谱被称为表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）[8-11]。同时，SERS光谱还具有检测快速与特异性好等优点，因此被广泛用于苹果中各种农药残留的快速检测。Kumar等[12]采用SERS技术结合快速预处理方法，实现了苹果皮中的福美双残留的快速检测，最低检测限为 2.4×10-9g/cm2，比国标规定降低了 3个数量级。Mandrile等[13]以不同尺寸的金纳米颗粒为增强基底，结合SERS技术快速检测苹果汁中的嘧霉胺，最低检测浓度达 5 mg/L。Tang等[14]利用非平面SERS技术，检测苹果中的毒死蜱和吡虫啉农药残留，检测最低浓度分别为0.01 mg/L和0.05 mg/L。Fu等[15]合成金纳米棒阵列和固相萃取净化技术快速检测苹果中的噻苯咪唑农药，最低检出限达到 0.06 mg/L。Hussain等[16]利用双金属核壳纳米粒子做SERS基底检测苹果提取物中的齐拉姆，检测限达到0.015 mg/kg。但是，为了实现低浓度农药的准确检测，一些样本在预处理过程中会被破坏[17-18]。所以在不破坏样本的前提下能够满足农药残留的国标检测要求，可以通过提高增强基底的性能来实现。SERS增强的机理可以用电磁机理和化学机理来说明。电磁机理是占主导地位的，因为化学机理仅对单分子产生10～104倍的增强，而电磁机理则给出108甚至更多的增强[19-20]。据资料显示[21-22]，银纳米粒子是用于拉曼信号增强的最有效金属粒子，SERS增强因子是金纳米粒子的 10～100倍。苹果农药多为酸性，采用银溶胶检测苹果表面农药残留时适当控制银溶胶的 pH值对提高检测结果的稳定性具有重要的意义。

本文以改进的银溶胶为增强基底，以苹果中的啶虫脒农药为研究对象，在不破坏样本的前提下将银溶胶滴加到苹果上采集光谱，结合化学计量学方法[23-24]不仅满足了国标要求的苹果中啶虫脒残留检出限要求，还实现了量化分析。希望通过本研究为农产品安全检测提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

采用实验室自行搭建的便携式拉曼光谱系统[25-27]采集苹果表面的光谱信息，激发光波长为785 nm，积分时间 2 s，激光功率 350 mW，采集范围在 200～2 650 cm-1。

纯度99.9%的啶虫脒原药购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，质量分数 10%的啶虫脒乳油购于天津华宇农药有限公司，聚丙烯酸钠（sodium polyacrylate，PAAS）、硝酸银、丙酮、盐酸羟胺、氢氧化钠、氯化钠购于上海源叶生物科技有限公司，纯度 98%，超纯水购于北京蓝弋化工有限公司。

1.2 银溶胶制备

纳米银胶体是基于 Leopold等[28]的方法，首先制备1.1×10-3mol/L硝酸银溶液90 mL备用，然后将盐酸羟胺与氢氧化钠溶解于10 mL去离子水中，制备成浓度分别为1.5×10-2mol/L和3.0×10-2mol/L的混合溶液，将新鲜制备的混合溶液迅速倒入90 mL硝酸银溶液中，并持续搅拌30 min得到灰绿色银溶胶，最后将所得银溶胶与等体积PAAS（0.5%）混合，得到稳定的银溶胶溶液，保存于4 ℃黑暗环境下。

1.3 增强基底影响因素

以氯化钠作为增强基底的团聚剂[29]，取氯化钠固体分别配制0.2、0.5、1.0、2.0 mol/L氯化钠溶液50 mL，以10 mg/kg的啶虫脒溶液为底物，用于探究增强效果的变化。同时配制40 mmol/L的硝酸溶液用于调节银溶胶的酸碱度（pH值），用以改进银溶胶的增强效果。

1.4 样品制备

利用10%啶虫脒乳油配制啶虫脒溶液，溶液质量分数从0.5%～10.0%，共24个浓度梯度。选用24个大小质量几乎一致的红富士苹果（购于北京美廉美超市），经去离子水洗涤并置于通风橱静置0.5 h晾干。据文献显示[30]，静置晾干后，将全果浸泡于 24个浓度梯度（0.5%～10.0%）的啶虫脒溶液5 min，然后静置于阴凉处48 h后，果肉中农药含量最接近全果农药含量。该方法不仅能够模拟农药从表面内吸及渗透进入果皮和果肉，而且从果梗处进入较多，符合实际使用中内吸农药从果树枝干经营养运输通道进入苹果果实的情况[31-32]。

1.5 光谱采集

将获得的含稳定剂 PAAS的银胶体溶液以2 000 r/min离心20 min，并通过超声重新分散在1 mL母液中。在采集光谱之前，先将丙酮（10μL）滴在苹果表面上，以使农药分子与果皮基质分离，然后加入5μL银胶体，再迅速加入适量硝酸溶液和氯化钠溶液，室温下利用实验室自行搭建的便携式拉曼检测系统采集苹果的拉曼光谱曲线。每个苹果在苹果表面采集均匀分布的 15个点，其中苹果果梗、花萼及最大圆周处各采集5个点，每个点采集 6次，通过对光谱进行平均处理得到的平均光谱作为样品原始光谱。

1.6 气相色谱法检测苹果农药含量测试

将采集光谱后的苹果迅速放入密封袋中，参照国家标准方法GB/T 5009.110—2003和GB/T 5009.146—2008，采用气相色谱法对苹果中啶虫脒含量进行检测。

1.7 拉曼光谱分析

拉曼光谱信号采集的过程中，由于外界环境和系统自身的稳定性等方面因素的影响，使采集的光谱除了样品自身有用信息外，还包含了其他无关的信息和噪声。因此，为了消除这些无关信息和噪声，保证光谱和农药浓度之间具有良好的相关性，需要对原始光谱进行预处理。本研究基于蚁群算法改进的拉曼特征寻峰方法，将多次采集的梯度浓度范围的农药拉曼光谱进行统计分析，用于特征峰识别定性农药种类，便于去除无关的光谱信息。还有基于卡尔曼滤波器的卡尔曼平滑算法，不要求信号和噪声都是平稳的，通过前向递进和后向递进的方法得误差最小即最优估计的真实值，从而最大程度上去除光谱信号的噪声，提高分析精度。非对称重加权惩罚最小二乘法（asymmetrically reweighted Penalized Least Squares，arPLS）能自动拟合并去除光谱基线和校正拉曼特征峰值。扩展乘性散射校正（Extended Multiplicative Signal Correction，EMSC）用于光谱散射校正结合偏最小二乘回归算法（Partial Least Squares Regression，PLSR）建立定量预测模型，能提高模型精度。比较校正集的相关系数（correlation coefficient，Rc）与预测集的相关系数（prediction coefficient，Rp）、校正均方根误差（Root Mean Square Errors of calibration，RMSEc）和预测均方根误差（Root Mean Square Error of predictions，RMSEp）来评价模型。

2 结果与分析

2.1 银溶胶SERS基底的表征

用紫外分光光度计对银溶胶的紫外吸收光谱进行表征，如图1所示，在416 nm处观察到了明显的银纳米粒子等离子体共振吸收峰，吸收峰为窄峰，说明制备的银溶胶为单分散系，较多分散系溶胶，粒子均一性更好。

2.2 农药和苹果谱带归属

由于拉曼光谱的峰位反映物质化学键的振动或转动频率，因此不同位置的拉曼峰可代表不同化学键，反映分子的结构信息，从而通过拉曼光谱可以确定分子的结构，同样分子的化学键等结构信息也表现在拉曼光谱上。通过在苹果上滴加银溶胶分别采集不含农药的洗净苹果和含国标限浓度0.8 mg/kg啶虫脒的苹果的SERS光谱以及啶虫脒原药的拉曼光谱如图2所示。从图2的数据可见，无农药苹果样品的拉曼光谱曲线没有明显的拉曼峰。啶虫脒农药拉曼峰主要在634 cm-1，842 cm-1，1 114 cm-1，1 294 cm-1和2 196 cm-1处出现，分别对应C—Cl伸缩、环振动和环“呼吸”、环伸缩和C=N伸缩谱带。含啶虫脒农药的苹果样品的SERS光谱拉曼峰主要在627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-1处出现，分别是Cl伸缩、环“呼吸”和环伸缩谱带[8]。因为不同谱带的化学键类型和结构不同，银溶胶 SERS基底的增强作用也不同，627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-1处拉曼特征峰最能代表啶虫脒农药SERS光谱信息。

2.3 pH值对银胶体的影响

采用银胶体对苹果表面农药进行增强时，由于其pH值不同，增强效果也不同，苹果表面啶虫脒农药本身呈现弱酸性，若采用碱性银胶体，酸性农药在碱性环境下可能会发生化学反应。因此有必要试验不同pH值的银胶体对增强效果的影响。试验过程采用1 mol/L的NaCl作为团聚剂，通过配制的40 mmol/L的硝酸溶液去改变银胶体的pH值，并用pH计控制，得到pH值分别从2.5～7的不同酸碱度的增强基底，并用这些基底去测试相同的10 mg/kg的啶虫脒溶液，结果如图3所示，整体趋势是增强基底的增强效果随着pH值的减小而减弱。这是因为用盐酸羟胺与NaOH制成的银胶粒子表面有偶电层（Ag+为负吸附质），H+被静电力吸引聚集在表面等离子共振体上，抢占了啶虫脒分子的活性热点。随着pH值下降，H+增多，银溶胶的增强效果会大大下降。但是pH值为7时，相比于pH值为6.5，增强效果变低。这是因为啶虫脒农药本身是呈弱酸性的，只有在这种条件下啶虫脒分子能够尽可能的吸附到银溶胶粒子上，而pH值为7时啶虫脒已经消耗掉一些，所以反而增强效果没有 pH值为6.5时的好。从图3中可以看出，当pH值为6.5时，检测效果较好。

2.4 NaCl团聚剂对银胶体的影响

表面增强效应因金属纳米粒子和不同待测分子的电荷属性和结合程度之间的差异，导致吸附程度的不同给拉曼光谱进行低浓度物质的分析带来挑战。在不加入团聚剂时，仅仅依靠 Ag+的电化学性质和结构特征进行增强，针对苹果表面啶虫脒检测限较高，不能满足检测要求。因此向银溶胶中引入电解质作为团聚剂可以改善表面增强的效果[33]。通过向银溶胶中引入团聚剂NaCl，加快结合速度来改善银溶胶增强效果。使用NaCl作为团聚剂是因为银溶胶属于惰性溶胶，对电解质比较敏感，胶粒的稳定性完全靠吸附保护剂和建立双电子层来维持。当体系中加入电解质会破坏电荷平衡，从而导致粒子聚沉。适当的引入电解质可以使粒子聚集，快速创造更多的活性热点，提高增强效果。同时啶虫脒表面的Cl原子易发生拉电子效应，CN和CN发生共轭诱导效应，故带有一定的负电荷。而在酸性条件下溶胶粒子表面正电荷居多，使啶虫脒分子更容易接近银溶胶。但是过量的Cl-引入会使粒子聚集越来越大，反而使活性热点减少，最后聚沉，正如图4中数据可见，NaCl溶液浓度从0上升到1 mol/L时啶虫脒的光谱也随之增强，而NaCl溶液浓度为2 mol/L时却会引发聚沉，增强效果大打折扣，因此当NaCl溶液浓度为1 mol/L时，检测效果最好。

在确定合适NaCl（1 mol/L）浓度后，向25μL银溶胶中加入体积为5、10、15、20和25μL的1 mol/L NaCl溶液采集10 mg/kg啶虫脒溶液SERS光谱来探究NaCl溶液与银溶胶比例对啶虫脒检测的影响。如图5中数据可见，当1 mol/LNaCl溶液加入量超过5μL时，增强效果开始下降。所以选取1 mol/L NaCl溶液与银溶胶按照 1∶5的比例混合能有效的提高啶虫脒检测效果。

2.5 改进的银溶胶的稳定性研究

为了评估按照上述方法改进后的银溶胶对啶虫脒的增强效果的稳定性，采用改进的银溶胶与原始银溶胶分别对10 mg/kg啶虫脒溶液采集20次SERS光谱。结果如图6所示，使用改进后的银溶胶对同样浓度的啶虫脒检测时拉曼信号更好。对比了627，835和1 107 cm-13个特征峰强度在两种银溶胶增强效果如表1所示，使用改进后的银溶胶的特征峰离散程度更小，分布更为集中。而且通过提取并计算 3个特征峰强度值的变异系数，发现在使用改进的银溶胶后 3个特征峰强度值的变异系数均有明显降低，特别是在1 107 cm-1处较为明显。经过综合分析表明，使用了改进的银溶胶后，对于啶虫脒的SERS光谱稳定性有了明显的提升，有利于进一步进行苹果中啶虫脒农药残留的定量分析。

表1 啶虫脒表面增强拉曼特征峰值强度及变异系数Table 1 Coefficient of variation of SERS characteristic peaks intensity of acetamiprid

2.6 苹果中啶虫脒残留的定量分析

2.6.1 重复性试验

取30个苹果，用20 mg/kg的啶虫脒溶液在相同条件下制备，调整银胶体pH值为6.5并采用1 mol/L的NaCl溶液作为团聚剂进行试验，采集苹果表面SERS光谱后经荧光背景扣除后，计算啶虫脒SERS光谱在627，835和1 107 cm-1处的特征峰强度的相对标准偏差分别为6.14%、6.83%、6.99%，表明该测试方法的重复性良好，能够用于定量分析。

2.6.2 确定最低检出限

取24个苹果，分别配制了0.012～10.830 mg/kg的24个浓度梯度用于制备苹果样本，采集其SERS光谱，经基线扣除和寻峰算法处理，结果如图7所示。

由于寻峰算法是基于特征峰数量最小为2以及3倍噪音原理，所以在此方法下啶虫脒的最低检出限可以达到 0.035 mg/kg，远低于国家标准允许最大检出限0.8 mg/kg[34]，较原始银溶胶最低检出限0.15 mg/kg也有降低[8]。

2.6.3 建立定量预测模型

选取24个苹果在检测范围内配制0.082～3.830 mg/kg不同浓度啶虫脒农药，在采集完SERS光谱后，在浓度梯度范围内均匀选取18个苹果做校正集，6个苹果做验证集。由于采集到的苹果拉曼光谱包含荧光噪音信号，因此需要对数据进行预处理，在不改变光谱性质的情况下消除噪音信号，本文比较了在PLSR算法下不同预处理方式的建模效果，发现卡尔曼平滑+扩展乘性散射校正+基线扣除的组合预处理效果较优，Rp达到了0.935，RMSEP为0.067 2 mg/kg，如表2所示。基于较优的预处理方法分别用PLSR和MLR建模，比对建模效果。同时也对啶虫脒的拉曼特征峰建模效果进行比对，结果如表3所示，PLSR（Partial Least Squares Regression）建模效果要优于MLR（Multiple Linear Regression），并且考虑到至少需要2个特征峰来确定物质的存在，对627 cm-1和835 cm-12个特征峰建模的效果要优于对 627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-13个特征峰，相关系数Rp达到了0.974。

表2 啶虫脒农药不同预处理方式下的预测结果Table 2 Prediction results of different pretreatment methods of acetamiprid

表3 啶虫脒农药不同建模方式下的结果Table 3 Results of different modeling methods for acetamiprid

综上，以卡尔曼平滑+扩展乘性散射校正+基线扣除的组合做预处理，选择627 cm-1，835 cm-1处的特征峰拉曼强度建立的偏最小二乘回归预测模型效果较佳，校正集相关系数Rc为 0.986，校正集均方根误差 RMSEc为0.0369 mg/kg，验证集相关系数Rp为0.974，校正集均方根误差RMSEp为0.044 1 mg/kg。可以很好地实现对苹果中啶虫脒残留的准确检测，为农产品中农药残留检测提供了一条新的分析途径。

3 结 论

利用 SERS技术结合化学计量学方法实现苹果中啶虫脒残留的准确检测。

1）本文通过控制银溶胶pH值为6.5，调整农药在银胶体粒子表面吸附状态，使得检测效果更好。

2）探索了团聚剂与银溶胶 1∶5的比例向银溶胶中加入1 mol/L NaCl溶液，可以促进啶虫脒分子与银溶胶吸附，提高拉曼信号的同时，降低了啶虫脒在苹果中的最低检出限以及提高检测精确度。

3）本文的研究方法在苹果无需前处理是情况下，对苹果中啶虫脒最低检出限可达0.035 mg/kg，低于国家规定的农作物农药最大残留限。

4）啶虫脒残留的量化分析通过利用卡尔曼平滑结合扩展乘性散射校正和基线扣除法作为预处理方法，选取627，835 cm-1处的特征峰强度来建立偏最小二乘回归模型。优化模型的预测相关系数Rp为0.974，分析误差达到RMSEp为0.044 1 mg/kg。由此可知，SERS结合化学计量学方法可以很好地实现苹果中啶虫脒残留的准确检测。