乙二醇-氯化铁预处理对棉秆酶水解效率的影响

董 倩，唐 松，徐禄江，方 真

（南京农业大学工学院，南京 210031）

0 引 言

中国是棉花种植和生产第一大国，棉秆作为主要副产物年产量达5 400多万t[1]，目前对棉秆的处理方式多是随意丢弃或燃烧，这造成了环境污染和资源浪费[2]。棉秆的主要组分为纤维素（32%～46%）、半纤维素（20%～28%）和木质素（17%～26%）[3]。棉秆的致密结构和复杂组分限制了其直接转化成生物燃料和化学品的效率[4]。因此，需要对棉秆进行预处理，选择性分离其中的木质纤维素组分，打破致密紧凑的物理屏障[5]，提高水解棉秆制备可发酵性糖的效率，为生产生物燃料和化学品提供可持续的生物基原料[6-7]，有利于促进棉秆的资源化和高值化利用。

研究表明硫酸[8-9]、硝酸[10-11]和盐酸[12-13]等传统无机酸催化预处理生物质，虽能有效分离木质纤维素组分，实现纤维素酶的高效水解，但对设备的耐腐蚀性要求高，且易产生发酵抑制物，不适于规模化生产[14]。目前，研究学者采用路易斯酸（如氯化铁[15]）替代传统无机酸作为催化剂用于生物质的预处理，其原因是路易斯酸溶于水后生成的水合氢离子能有效破坏木质纤维素的紧密结构，实现木质纤维素组分的有效分离，达到传统酸预处理效果的同时还可规避对设备的腐蚀等缺点[16-17]。氯化铁作为催化剂进行预处理能有效水解半纤维素组分，并留下更容易被酶水解的固体残留物[18]，此外，Fe3+离子对酶活性有积极影响[19]，常用于糖发酵培养基的制备[20]。Zhang等[21]利用FeCl3催化水热预处理（160 ℃和30 min）甘蔗渣，半纤维素几乎被完全去除，但仍含有 44%碱木质素。Chen等[22]利用 FeCl3催化水热预处理（170 ℃和30 min）甘蔗渣、水稻秸秆和桉木，大量半纤维素被去除，但木质素无明显变化。氯化铁催化高温水热预处理能够去除生物质中大量半纤维素，但对木质素几乎无影响。为了提高木质素的分离，需要找到可有效替代水的溶剂。乙二醇因具有很好的木质素溶解性而被广泛用于生物质预处理[23-24]。Wei等[25]利用酸碱催化乙二醇预处理甘蔗渣，乙二醇-盐酸预处理能够去除99.3%半纤维素和67.1%木质素，乙二醇-氢氧化钠预处理去除 90.9%木质素和28.8%半纤维素。以上两种预处理都没有达到同时高效去除木质素和半纤维素的效果。因此，将乙二醇和氯化铁联合运用于生物质预处理以期达到优势互补，提高木质纤维素组分的分离效果。目前关于乙二醇结合氯化铁用于预处理棉秆以提高其纤维素酶水解效率的研究鲜有报道。

本研究以棉秆为原料，探索乙二醇-氯化铁的预处理工艺，通过正交试验对预处理条件进行优化，并在此基础上优化酶水解条件，以期实现棉秆的高效酶水解。通过表征分析探究乙二醇-氯化铁预处理条件对脱除棉秆木质素和半纤维素的影响，以及预处理条件和酶水解条件对提高酶水解效率的作用机理，为棉秆的预处理提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验原料与试剂

试验中所用试剂：六水合氯化铁（≥99.0%）、乙二醇（≥99.5%）、硫酸（≥98.0%）、3,5-二硝基水杨酸（≥ 95.0%）、氢氧化钠（≥96.0%）、酒石酸钾钠（≥ 99.0%）、苯酚（≥99.0%）、偏亚硫酸氢钠（≥99.0%）、柠檬酸三钠（≥99.5%）和柠檬酸（≥90.0%）均为分析纯，购买于国药集团化学试剂有限公司（上海）；碳酸钙（≥ 99.0%；分析纯）购买于西陇化工股份有限公司（广东佛山）；甲醇（≥99.0%）、葡萄糖（≥99.0%）、木糖（≥ 99.0%）、阿拉伯糖（≥99.0%）均为分析纯，购买于阿拉丁生化股份有限公司（上海）；纤维素酶（Cellic®CTec2，SAE0020-50 mL）购买于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，根据美国国家可再生能源试验室（US National Renewable Energy Lab，NREL）的酶活测定方法[26]进行纤维素酶活测定，纤维素滤纸酶活为166 FPU/mL。

棉秆收集于新疆维吾尔自治区喀什地区巴楚县，自然风干后（含水率 8.8%），经机械粉碎，过直径 0.425～0.250 mm筛，密封常温保存。棉秆含有 32.9%纤维素，16.3%半纤维素，27.8%木质素，7.4%醇溶性物质，6.7%其他物质（灰分、蜡质和可溶性糖等）。

1.2 预处理反应装置

乙二醇-氯化铁预处理反应装置如图1所示，主要有三口烧瓶、加热套、热电偶、冷凝器和机械搅拌器组成。

1.3 乙二醇-氯化铁预处理方法

1.3.1 乙二醇预处理体系催化剂的选择

采用单因素试验研究催化剂及其浓度对棉秆组分变化的影响。准确称取2.5 g棉秆放入100 mL西林瓶中，加入50 mL 90%乙二醇的水溶液（乙二醇与去离子水的体积比为9∶1）和 0.1 mol/L催化剂或0～0.15 mol/L 氯化铁，混合均匀，放入灭菌锅，升温至 121 ℃后保持60 min，冷却至室温取出。用G1砂型漏斗（80～120μm孔径）过滤，加入去离子水将固体部分洗至中性，即得预处理后棉秆样品，真空冷冻（-48 ℃，48 h ）干燥后，密封保存备用。

1.3.2 乙二醇-氯化铁预处理正交试验

采用正交试验设计优化预处理条件，确定棉秆乙二醇-氯化铁预处理的主要因素为氯化铁浓度、固液比、预处理时间和温度，每个因素取 5个水平，试验因素及水平见表1。

表1 棉秆乙二醇-氯化铁预处理正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design for ethylene glycol-ferric chloride pretreatment of cotton stalks

准确称取不同质量（3.3～10 g）的棉秆置于三口烧瓶（500 mL）中，加入100 mL 90%乙二醇的水溶液，固液比分别达到1∶10～1∶30，加入不同浓度（0.02～0.18 mol/L）的氯化铁。将三口烧瓶置于加热套（ZNHW 500 mL，河南爱博特科技公司，郑州）中进行加热，同时利用机械搅拌（150 r/min）进行混匀，待温度升至设定值（130～170 ℃），恒温处理一段时间（20～60 min） 后，自然冷却至室温。采用真空抽滤，利用G1砂芯漏斗进行固液分离。用去离子水将固体残渣部分洗至中性，通过真空冷冻干燥器进行干燥（-48 ℃，48 h ），密封保存备用。

1.4 纤维素酶水解方法

准确称取1.0 g预处理前后棉秆分别放入100 mL丝口瓶中，加入20 mL柠檬酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 值4.8，基质浓度5%）和不同量（1.66、4.15、6.64、8.3和12.45 FPU/g）的纤维素酶，封盖后置于 50 ℃恒温摇床（150 r/min）进行水解反应。分别于24、48和72 h时取样，样品离心（6 000 r/min，2 min），取上清液过膜（0.22μm）后，采用高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测分析样品中葡萄糖的浓度，并以此计算棉秆经纤维素酶水解的葡萄糖产率。

式（1）中，采用葡萄糖产率评估生物质样品的纤维素酶水解效率。

1.5 检测分析方法

根据 GB 5009.3—2016标准[27]测定样品中水分含量。根据NREL提出的生物质中抽提物[28]和碳水化合物[29]的分析方法，首先利用索氏抽提器对样品进行醇提，再依次经过两步酸水解、抽滤、干燥、焙烧等处理，测定生物质中的醇溶性物质和木质纤维素组分的含量。采用HPLC定量检测样品中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度，然后计算样品中的纤维素和半纤维素含量。其中，HPLC检测中所用色谱柱为 Aminex HPX-87C，流动相为0.005 mol/L硫酸溶液，流动相的流速为0.6 mL/min，色谱柱箱的温度为60 ℃。相关组分计算公式如下

式（4）中0.087为液体体积；0.9为由葡萄糖计算纤维素含量的校正因子，0.97为葡萄糖在高压灭菌锅中的损失校正系数。

式（5）中0.087为液体体积系数；0.88为由五碳糖（木糖和阿拉伯糖）计算半纤维素含量的校正因子，0.84、0.89分别为木糖、阿拉伯糖在高压灭菌锅中的损失校正系数。

式（6）中，UV-abs为样品在198 nm波长处的平均UV-Vis吸光度；ε为生物量在特定波长的吸收能力（取55 L/g·cm）；V为液体总体积，87 mL。

预处理后固体残渣中的纤维素、半纤维素和木质素含量同样采用 NREL的组分分析方法[25]测定，并用于计算纤维素回收率，半纤维素和木质素的去除率。

1.6 表征分析方法

利用热重分析仪（TGA；Pyris 1 DSC，PerKinElmer，Waltham，Massachusetts）检测样品的热稳定性。采用氮气物理吸附-脱附仪（Nova 4200e，Quantachrome Instruments，Boynton Beach，FL），并结合Barrett-Emmet and Taller（BET）和Barrett-Joyner-Halenda（BJH）方法对样品的比表面积、孔隙体积和孔半径进行分析[30]。利用装备有铜靶的X射线衍射仪（XRD；X’TRA，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Massachusetts）分析样品的纤维素结晶度（Crystallinity of cellulose，CrI），入射波长λ=0.154 nm，扫描范围 2θ= 5°～55°，扫描速度 2( °)/min。根据样品的XRD曲线计算样品的纤维素结晶度CrI[31]

式（13）中I002表示纤维素结晶区对应的衍射峰强度，其对应角度为2θ≈ 22.5°（θ是XRD图谱上衍射角度）；Iam表示纤维素非结晶区对应的衍射峰强度，其对应角度2θ≈18.7°。

2 结果与分析

2.1 乙二醇预处理体系催化剂的选择结果分析

在121 ℃，反应时间60 min，固液比1∶20条件下，考察了催化剂及其浓度对棉秆组分变化的影响。表2试验结果表明，路易斯酸对木质纤维素的组分分离具有促进作用，其原因是路易斯酸溶于水产生的水合氢离子（H3O+）能够破坏木质纤维素致密复杂的结构。相较其他路易斯酸，氯化铁对纤维素的回收、木质素和半纤维素的去除具有较好选择性。在乙二醇预处理中加入氯化铁对半纤维素的去除具有显著效果，低浓度时对木质素的去除基本无影响，这与已有研究报道一致[26]。增大氯化铁浓度至0.07 mol/L后，木质素去除率显著提高，其原因是氯化铁浓度增加使溶液酸性增强，加剧了预处理反应，对木质纤维素结构的破坏程度增强，从而使木质素分离。在0.15 mol/L 氯化铁条件下，乙二醇-氯化铁预处理棉秆半纤维素和木质素去除率分别为 80.83%和63.74%，相较单一乙二醇的水溶液预处理，半纤维素和木质素去除率分别提高349.8%和108.0%。

表2 棉秆乙二醇预处理的催化剂选择试验结果Table 2 Results of catalyst selection for ethylene glycol pretreatment of cotton stalks

2.2 乙二醇-氯化铁预处理条件的优化

如表3所示，分别以葡萄糖产率，纤维素回收率，半纤维素和木质素去除率为指标设计正交试验以优化棉秆的乙二醇-氯化铁预处理条件。试验结果表明，纤维素回收率随氯化铁浓度增大而降低，这说明高浓度氯化铁会加剧木质纤维素的解构作用，尤其当氯化铁浓度超过 0.1 mol/L时，纤维素发生显著降解。表4和表5分别为针对表3中半纤维素和木质素去除率的极差和方差分析，结果表明，在棉秆的乙二醇-氯化铁预处理过程中，各因素影响半纤维素和木质素去除率的顺序为：氯化铁浓度＞固液比＞反应温度＞反应时间。分析可知最优的预处理条件为：氯化铁浓度0.1 mol/L，固液比1∶15，温度160 ℃和时间20 min。在此条件下，棉秆的纤维素回收率、半纤维素和木质素去除率分别为 79.72%、88.86%和 85.74%，棉秆纤维素含量提高133.0%，半纤维素和木质素含量分别降低67.2%和58.0%。预处理后棉秆中纤维素、半纤维素和木质素含量分别为74.12%、5.36%和11.68%。Wang等[32]对比分析了稀硫酸预处理、超声辅助碱预处理和高温辅助碱预处理对棉秆组分的影响，发现预处理后棉秆纤维素含量较低（51%～64%），且木质素含量较高（21%～32%）。Singh等[33]研究了微波辅助氯化铁预处理棉秆，发现预处理后棉秆纤维素、半纤维素和木质素含量分别为 52%、16%和 12%。对比之下，本预处理方法在高效去除棉秆木质素和半纤维素的同时，可有效保留纤维素，说明乙二醇-氯化铁预处理工艺较其他预处理方法在棉秆组分分离方面具有一定优势。

表3 乙二醇-氯化铁预处理棉秆去除木质素和半纤维素的试验结果Table 3 Experimental results of ethylene glycol-ferric chloride pretreatment for removal of lignin and hemicellulose of cotton stalks

表4 乙二醇-氯化铁预处理正交试验的极差分析Table 4 Range analysis of orthogonal experimental forethylene glycol-ferric chloride pretreatment

表5 乙二醇-氯化铁预处理正交试验的方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experimental for ethylene glycol-ferric chloride pretreatment

2.3 乙二醇-氯化铁预处理对棉秆酶水解的影响

表3对比分析了不同乙二醇-氯化铁预处理条件下棉秆的纤维素酶水解效率，结果表明，在0.1 mol/L氯化铁、固液比1∶15、160 ℃和20 min条件下预处理后棉秆的葡萄糖产率达到了最高（88.45%），较未处理棉秆（11.14%）提高了694.0%倍，这说明乙二醇-氯化铁预处理能有效提高棉秆的酶水解效率，这是因为预处理去除了棉秆中大量的木质素和半纤维素[30]。此外，为确定最优酶水解条件，进一步考察了不同酶载量（1.66、4.15、6.64、8.3和12.45 FPU/g）和酶水解时间对预处理（0.1 mol/L氯化铁、固液比1∶15、160 ℃和20 min）后棉秆的葡萄糖产率的影响，结果如图2a、2b所示。由图2a可知，酶载量从1.66增加至8.3 FPU/g，预处理后棉秆的葡萄糖产率得到显著提高，8.3 FPU/g时达到88.5%，是1.66 FPU/g的4倍。继续增加酶载量，预处理后棉秆的葡萄糖产率变化较小（89% ～93%），这可能是由于水解过程中参与水解的纤维素酶已经达到饱和状态[34]。因此，最优酶载量为8.3 FPU/g。在此基础上，研究了不同酶水解时间对酶水解效率的影响。由图2b可知，棉秆酶水解效率与水解时间呈正相关，并在72 h时的葡萄糖产率达到100%，远高于水解24 h的葡萄糖产率（68%），所以最优水解时间为72 h。

为明确乙二醇-氯化铁预处理是如何影响，并改善棉秆酶水解效率的机制，本研究利用一系列分析仪器对预处理（0.1 mol/L氯化铁、固液比1∶15、160 ℃和20 min；木质素和半纤维素去除率分别为88.9%和85.7%）前后棉秆的微孔特征、结晶度以及热稳定性等理化性质进行表征分析。

2.4 表征分析

2.4.1 BET分析

利用氮气（N2）物理吸附-脱附仪对未预处理和最优预处理条件下处理后的棉秆的物理特性进行测定，分析结果见表6。由数据可知预处理后棉秆比表面积、孔容和孔半径均有不同程度的增大，这意味着棉秆与纤维素酶或其他微生物的可接触面积增大，这有利于后续的纤维素酶水解和发酵。

表6 预处理前后棉秆的物理化学特性变化Table 6 Physicochemical properties of untreated and pretreated cotton stalks

2.4.2 XRD分析

利用X射线衍射仪对预处理前后的棉秆进行纤维素结晶度分析，衍射图谱见图3，由图可知，在2θ≈ 22.20°和2θ≈15.40°处均出现了衍射峰，根据相关研究文献可知[26]，2θ≈ 22.20°处是纤维素 I结晶区的特征峰，2θ≈ 15.40°处是纤维素I无定形区的特征峰。由计算公式（13）算出未处理和预处理后棉秆的结晶度分别为 45.19%和49.49%，经过预处理后棉秆的结晶度有略微升高（9.52%），推测其原因是预处理去除了部分半纤维素和木质素，使纤维素溶出部分增多，从而导致结晶度稍有升高，这一趋势与大多数文献报道结果一致[30,35]。

2.4.3 TGA分析

Yang等[36]研究发现纤维素、半纤维素和木质素降解温度的区间分别为240～390、160～360和100～900 ℃。图4为不同样品经10 ℃/min加热至600 ℃过程中的质量保留分数(ω)-温度（Thermogravimetric analysis，TG）和质量变化速率(dm/dt)-温度（Derivative thermogravimetric analysis，DTG）的曲线，基质最大失重速率发生在 297～372 ℃，棉秆原料在 329 ℃时失重最快，预处理后，其最大失重发生在 344 ℃。此外，在400 ℃时，棉秆原料失重 63%，预处理后，失重增加到89%，这说明预处理后棉秆的热稳定性显著降低。

综上所述，棉秆经乙二醇-氯化铁预处理（0.1 mol/L氯化铁，160 ℃和20 min）后，去除大量木质素（85.74%）和半纤维素（88.86%），葡萄糖产率提高 7.6倍，达到100%，这主要是因为乙二醇-氯化铁预处理后，棉秆致密结构被破坏，更多的内部纤维被暴露出来，其比表面积、孔径和孔容显著增加，极大改善了对纤维素酶的可及性，提高了酶水解效率。预处理后棉秆的结晶度有略微升高，但对预处理效果没有明显影响，可能并不是影响秸秆酶水解的主要因素[30]。

3 结 论

本文研究了乙二醇-氯化铁预处理中氯化铁浓度、固液比、反应时间和温度对棉秆物理特性和主要化学组分等的影响，并进一步研究了预处理条件、酶水解时间和酶载量对棉秆酶水解效率的影响，主要结论如下：

1）乙二醇-氯化铁预处理最优条件为0.1 mol/L 氯化铁、90%乙二醇水溶液、固液比1∶15、160 ℃、20 min，该条件下棉秆的纤维素回收率、木质素和半纤维素去除率分别达到79.72%、85.74%和88.86%，棉秆纤维素含量提高133.0%、半纤维素和木质素含量分别降低 67.2%和58.0%。葡萄糖产率达到88.45%（酶载量8.3 FPU/g，底物浓度 5%，pH 值 4.8，温度 50 ℃，恒温摇床转速150 r/min酶解48 h）相较未处理棉秆提高694.0%。

2）通过对酶水解时间和酶载量的优化，发现在 5%底物浓度，酶载量8.3 FPU/g，pH 值4.8条件下50 ℃恒温水解72 h后，棉秆的葡萄糖产率达到100%。

3）通过BET、TGA和XRD等分析手段，对预处理前后棉秆的物理特性、结晶度和热稳定性进行了表征，预处理后棉秆纤维素的结晶度升高9.52%，比表面积、孔容和孔径均有增大，热稳定性显著降低，这有利于后续生物转化利用。