HCC病灶EphB4表达水平与超声造影灌注参数的相关性

盛陈卓娅,姚根新,张心荣,李 东

盛陈卓娅,浙江省湖州市德清县人民医院病理科 浙江省湖州市313200

姚根新,浙江省湖州市德清县人民医院超声科 浙江省湖州市 313200

张心荣,浙江省湖州市德清县人民医院超声科 浙江省湖州市 313200

李东,浙江医院超声科 浙江省杭州市 310013

0 引言

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的肝脏恶性肿瘤,其病死率居恶性肿瘤第二位,恶性程度高,转移率高,预后较差[1,2].HCC发生发展涉及多基因的调控表达[3].酪氨酸蛋白激酶受体B4(ephrin type-B receptor 4,EphB4)是酪氨酸蛋白激酶受体家族中的一员,大量研究证实EphB4在多种人类恶性肿瘤中呈现高表达状态,具有重要临床意义[4].超声造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)能对组织的微循环血流状态进行定量分析,能动态真实反映其血供情况[5].本研究旨在检测HCC肝癌组织与癌旁组织的EphB4表达水平差异,分析EphB4表达水平与CEUS血流灌注参数的相关性,以期为临床判断病情、评估预后提供依据.

1 材料和方法

1.1 材料 选择2019-02/2021-03期间,在我院行手术切除治疗的HCC患者作为研究对象,共52例,其中男38例,女14例,年龄28-77岁,平均55.9岁±13.2岁.纳入标准:(1)均为单发病灶;(2)均经病理证实为HCC;(3)术前未曾接受任何治疗;(4)无造影剂过敏;(5)能配合检查.病灶大小1.83 cm -5.78 cm,平均4.58 cm±1.04 cm.本研究经本院医学伦理委员会审批通过.所有患者均知情同意,并签署知情同意书.

1.2 方法 CEUS检查:采用Acuson S2000超声诊断仪进行检查,选择4C1探头(频率4.0 MHz),内置定量分析软件.首先行常规超声扫查,明确病灶位置、大小、边界、内部回声等一般情况.启动CEUS模式,以Sono Vue(意大利,Bracco公司)作为超声造影剂,按说明书制成混悬液.经肘部浅静脉快速推注2.4 mL,尾随生理盐水冲管,同步计时并存储动态图像资料作后续分析.分别于肝癌组织、癌旁组织(距离肿瘤病灶边缘1 cm处肝组织)选取实性部分作为感兴趣区,尽可能避开大血管、囊性区以及坏死区.感兴趣区选取深度、大小应保持一致.系统将自动生成时间-强度曲线,获得血流灌注参数:峰值强度(maximum intensity,IMAX)、达峰时间(time to peak,TTP)、流出时间(washout time,WT).由同一名经验丰富的副高职称超声科医师进行CEUS检查,所有数据均测量3次取平均值.见图1.

图1 CEUS灌注参数示意图.绿色线:肝癌组织的时间-强度曲线;黄色线:癌旁组织的时间-强度曲线.CEUS:超声造影;IMAX:峰值强度;TTP:达峰时间;WT:流出时间.

1.3 EphB4表达水平及微血管密度测定 术后获得HCC相应局部肝癌组织以及癌旁组织标本,用生理盐水洗净,加入RI-PA裂解液后充分研磨成研磨液,于4 ℃条件下离心20 min(12000转/min),分离上清液,采用酶联免疫吸附试剂盒(上海酶联生物科技有限公司提供)检测EphB4表达量.

采用ElivisionTM二步法免疫组化染色,严格按照Weidner等研究者报道的方法[6],首先在40倍光镜下观察整张病理切片,选取3个“热点”(血管高密度区),然后在200倍光镜下计数血管数.与周围血管、结缔组织细胞分开,且棕染的内皮细胞或内皮细胞簇作为一个计数微血管.计数3次,取平均值作为微血管密度(microvessel density,MVD)最终值(图2).

图2 MVD检测.在200倍光镜下,术后病理组织可见棕染的微血管.MVD:微血管密度.

统计学处理使用SPSS 20.0统计学软件分析数据.计量资料表示为mean±SD,组间比较采用t检验.相关性分析采用Pearson相关分析.P<0.05认为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 不同组织间CEUS灌注参数比较 肝癌组织IMAX明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05);肝癌组织TTP、WT明显短于癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05)(表1).

表1 不同组织间CEUS灌注参数比较

2.2 不同组织间EphB4表达水平及MVD水平比较 肝癌组织EphB4表达水平明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05);肝癌组织MVD明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05)(表2).

表2 不同组织间EphB4表达水平及MVD比较

2.3 CEUS灌注参数与EphB4表达水平相关性 肝癌组织中,EphB4表达水平与IMAX呈正相关(r=0.862,P<0.05),而EphB4表达水平与TTP、WT呈负相关(r=-0.765,r=-0.781,P<0.05).

3 讨论

HCC病灶内有着十分丰富的血供,这与病灶内血管新生过程旺盛密切相关[7].大量新生血管可为肿瘤组织细胞增殖、生长及发展提供充足养分.全面了解HCC肿瘤内的血供状态及组织细胞增殖情况,不仅能为临床判断病情严重程度提供依据,而且能为临床选择合适治疗方案提供参考.

CEUS作为近年来迅速发展起来的一项超声检查新技术,其在监测组织微循环灌注方面有着独特优势.CEUS是微米级纯血池血管示踪技术,能敏感动态反映组织内微循环血流,进而定量评估其血流特征[8].本研究结果显示,肝癌组织IMAX明显高于癌旁组织(P＜0.05),而TTP、WT明显短于癌旁组织(P＜0.05).提示肝癌组织的整体血流量较癌旁组织丰富,且其血流动力学特征为快速流入、达峰后快速流出,即为“快进快出”的造影模式.原因可能是,一方面HCC以动脉供血为主,肿瘤组织在多种血管生成因子作用下,生成大量不成熟微小血管,而这些微小血管具有较高通透性;另一方面,肿瘤组织内存在大量动静脉短路,导致肿瘤内血流量增大,流速增快[9].MVD是目前公认的能有效反映组织微血管生成状态的可靠指标.本研究结果显示,肝癌组织MVD明显高于癌旁组织(P＜0.05).进一步证实了HCC肿瘤组织内存在大量新生微小血管.HCC肿瘤内MVD明显增加,是导致肿瘤内血流量增加,流速增快的重要原因之一.

HCC内丰富的血供有利于肿瘤细胞增殖,而肿瘤细胞增殖受到原癌基因过表达影响.原癌基因具有促细胞增殖作用,在HCC病情发展中发挥着重要作用.EphB4作为 Ephrin家族中的一类酪氨酸蛋白激酶,一方面通过作用于Rac1/Akt通路,促进肿瘤细胞增殖,另一方面能通过作用于上皮间质转化过程,促进肿瘤细胞发生侵袭性生长[10,11].本研究结果显示,肝癌组织EphB4表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.05).提示EphB4表达水平上调与HCC发生发展密切相关.进一步分析HCC肿瘤组织血流灌注参数与EphB4表达水平的相关性显示:在肝癌组织中,EphB4表达水平与IMAX 呈正相关,而与TTP、WT呈负相关.提示HCC肿瘤组织的血流灌注状态与EphB4表达调控关系密切.随着HCC肿瘤组织内血供增多,流速增快,EphB4表达量随之上升,从而促进肿瘤细胞的增殖及转移.

4 结论

CEUS能定量评估HCC肿瘤组织的微循环血流状态,其血流灌注参数与EphB4表达水平具有一定相关性,可为临床评估EphB4表达水平提供参考.

文章亮点

实验背景

酪氨酸蛋白激酶受体B4(ephrin type-B receptor 4,EphB4)表达在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展过程中发挥着重要作用,而病理学方法评估EphB4表达状态具有创伤性,难以满足术前评估要求.超声造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)所具有的独特优势,可为临床无创性评估EphB4表达状态提供一种可靠手段.

实验动机

采用CEUS定量分析HCC组织的血流灌注变化,从而间接评估其EphB4表达水平,为临床无创性评估EphB4表达状态提供参考.

实验目标

采用CEUS定量分析HCC血流灌注状态,进而评估其EphB4表达水平.结果显示:CEUS血流灌注参数与EphB4表达水平具有相关性,可间接评估HCC的EphB4表达水平.

实验方法

本篇论文采用CEUS定量分析HCC血流灌注变化与EphB 4表达水平的相关性.CEUS是一种纯血池示踪方法,可定量分析目标组织的血流灌注特征.

实验结果

本篇论文研究达到了实验目标,研究结果显示肝癌组织峰值强度(maximum intensity,IMAX)、EphB4表达水平及微血管密度(microvessel density,MVD)明显高于癌旁组织(P＜0.05);肝癌组织达峰时间(time to peak,TTP)、流出时间(washout time,WT)明显短于癌旁组织(P＜0.05);肝癌组织EphB4表达水平与IMAX、TTP、WT具有相关性.本研究结果说明CEUS可无创性评估HCC的EphB4表达状态.

实验结论

本研究发现HCC血流参数与EphB4表达水平具有一定相关性.本研究提出CEUS能有效反映HCC的EphB4表达水平,从而指导临床治疗.

展望前景

CEUS检查时,患者尽量放慢呼吸频率,减少呼吸运动幅度,超声医师将肿瘤图像置于显示屏中央区域进行观察.本研究未来研究的方向是运用CEUS判定HCC组织EphB4表达水平的诊断效能.本研究未来研究的最佳方法是CEUS联合血管生成相关因子评估HCC的EphB4表达水平.