葡萄糖酸一步法制备虾壳葡萄酸钙

肖 晓，符汉麟，陈蓓蓓，莫玉剑，吴育廉

（广东海洋大学：1.化学与环境学院/ 2.滨海农业学院，广东 湛江 524088）

对虾养殖业作为我国水产养殖的代表产业之一，也是我国出口水产品的第一产业。为便于保鲜运输，对虾多以无壳虾仁供应全球市场，从而产生大量虾壳废弃物[1-2]。对虾虾壳中含有多种活性成分，目前其利用方式主要包括两种，一是直接粉碎作为动物饲料添加剂、鱼饵、肥料等[3]；二是通过精加工获得一些高附加值产品，如甲壳素、壳聚糖等，被广泛用于食品、医学、保健品等领域[4-6]。目前工业上多用酸碱法交替法处理虾壳制备甲壳素、壳聚糖，使得大量的钙质以废水形式排放，对生态环境和民生健康造成严重威胁，同时也产生巨大的资源浪费[7-8]。钙作为动物体内必需矿物元素之一，对动物生长发育具有重要的生理作用，而虾壳含有约20%的活性钙，可以作为优良的前驱体来制备钙营养补充剂[7]。因此，有效利用虾壳中的钙质成为虾壳资源化利用的关键。

葡萄糖酸钙具有高溶解性、良好生物相容性和安全无毒等优点，是国际公认的一种优质钙源[9]，在医药、食品等行业具有广泛应用,如作为钙营养剂添加在饮料、谷类产品中[10]。同时,葡萄糖酸钙还是一种临床常用药物，多用于治疗骨质疏松、皮肤过敏等病症[11]。目前，葡萄糖酸钙制备方法包括电解法、溴化法和发酵法、金属催化合成法、酶法等[12-13]，其中工业生产主要以黑曲霉发酵法为主。另外，也有研究者以鸡蛋壳或贝壳作为钙源来制备葡萄糖酸钙[6]。黑曲霉发酵法工艺比较复杂、操作条件相对苛刻；利用鸡蛋壳或被贝壳制备葡萄糖酸钙则需要进行高温煅烧，一定程度上造成能源浪费。目前尚未见采用葡萄糖酸与虾壳反应一步法制备葡萄糖酸钙的研究报道。因此，开展虾壳的葡萄糖酸脱钙工艺研究可为葡萄糖酸钙的制备提供新思路和一定的理论借鉴，同时也对提高虾壳的资源化利用具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜虾壳取自广东泰联海洋食品有限公司对虾加工生产车间，用水冲洗干净，70 ℃烘干破碎，后过孔径0.150 mm 筛，混匀备用。葡萄糖酸、盐酸、氨水、氯化铵、钙指示剂、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、碳酸钙等均为分析纯。AUY220 型电子分析天平，日本岛津；PHSJ-3F 雷磁酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；SHZ-D(III)鼓风干燥箱，巩义市瑞德仪器设备有限公司；SHA-B 水浴恒温振荡器，杭州旌斐仪器科技有限公司；Thermo Scientific Nicolet iS5 傅立叶变换红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；vario MACRO cube元素分析仪，德国元素分析系统公司。

1.2 实验方法

1.2.1虾壳脱钙实验 取一定量的虾壳粉置于锥形瓶中，按照一定料液比加入葡萄糖酸溶液，并将锥形瓶置于水浴恒温振荡器内，在预定温度条件下处理一段时间，过滤，洗涤滤渣，取滤液测定钙离子含量，计算脱钙率。

1.2.2单因素实验设计 以脱钙率为评价指标，分别研究葡萄糖酸浓度、反应温度、反应时间、料液比对虾壳脱钙效果的影响，具体条件如下。

葡萄糖酸浓度：控制反应温度为30 ℃，料液比1∶20 (g/mL)，反应时间2.0 h，葡萄糖酸的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mol/L；

反应温度：浓度为0.4 mol/L，料液比1∶20(g/mL)，反应时间2.0 h，反应温度为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃；

反应时间：控制葡萄糖酸浓度为0.4 mol/L，料液比1∶20 (g/mL)，反应温度为30 ℃，反应时间为0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 h；

料液比：控制葡萄糖酸浓度为0.4 mol/L，反应温度为30 ℃，反应时间为2.0 h，料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 和1∶25 (g/mL)。

1.2.3均匀实验设计 在单因素实验基础上，选取A1（料液比）、A2（反应温度）、A3（反应时间）、A4（酸浓度）为实验因子，以脱钙率为指标，采取拟水平均匀设计U10*(54)进行实验，实验结果用DPS 7.05 软件进行分析处理，得到对应的线性回归方程，预测最佳反应条件，并对得到最佳反应条件进行实验验证。

1.2.4脱钙率的测定

1.2.4.1虾壳总钙含量的测定 参考《GB5009.92-2016 食品安全国家标准 食品中钙的测定》检测样品中的钙含量[16]，具体操作：将一定量预处理的虾壳粉加入到1.0 mol/L 的盐酸溶液中，控制料液比为1∶20，在室温条件下反应24 h 后，过滤、洗涤滤渣，将滤液转入100 mL 容量瓶定容，取一定体积样液EDTA-2Na 标准溶液（0.01 mol/L）进行滴定，样品的总钙含量按式（1）进行计算。

其中P为样品中的总钙质量（单位：g）;c为EDTA-2Na 摩尔浓度（单位：mol/L）；V1为滴定样液所消耗的EDTA-2Na 的体积（单位：mL）；V0为滴定空白样品所消耗的EDTA-2Na 的体积（单位：mL）；V2为样液总体积（单位：mL）；V3为滴定所用样液体积（单位：mL）；M为EDTA-2Na 的摩尔质量（单位：g/mol）。

1.2.4.2钙离子标准曲线的测定 参考李文风等[17]测试方法：1）称取经干燥预处理的2.000 g 碳酸钙置于150 mL 烧杯中，缓慢加入3 mol/L 的盐酸溶液进行溶解，转入250 mL 容量瓶定容；2）准确吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 溶液至250 mL 锥形瓶中，用去离子水定容至100 mL，加入10 mL 氨水缓冲液，调节pH 约等于10，后加入少量铬黑T 指示剂，摇匀后用EDTA-2Na 标准溶液（0.01 mol/L）滴定至溶液变蓝色，记录消耗的EDTA-2Na体积；3）以消耗的EDTA-2Na 体积为横坐标，钙离子浓度为纵坐标绘制钙离子标准曲线，拟合得到线性回归方程。

1.2.4.3脱钙率的计算 称取与1.2.4.1 中相同质量的虾壳粉，用葡萄糖酸进行处理，取一定体积脱钙液按照1.2.4.2 的滴定操作得到消耗的EDTA-2Na体积，根据钙离子标准曲线计算钙离子浓度，后按公式（2）计算脱钙率：

其中，N为脱钙率（单位：%）；ρ为钙离子质量浓度（单位：g/L）；V为脱钙液总体积（单位：mL）；P为样品的总钙质量（单位：g）。

1.2.5数据处理 所有实验至少重复3 次，根据3次实验结果计算对应的标准偏差，以上所有指标以均值或均值±标准偏差进行表示。

2 结果与讨论

2.1 虾壳的总钙量

经测定，虾壳的总钙含量比例约为20.0%，略高于文献报道的钙含量（18.58%）[18]。这可能是由于来源或者生长周期不同的对虾其虾壳中钙含量存在一定的差异。

2.2 钙离子标准曲线

图1 为钙离子标准曲线，其对应线性回归方程为：ŷ=0.003 6x+0.000 3，其中y为钙离子质量浓度（单位：g/L）；x为消耗的EDTA-2Na 体积（单位：mL）。线性相关数R2=0.999 8，表明消耗的EDTA-2Na 体积与脱钙液中的钙离子浓度存在良好的线性关系。

图1 钙离子标准曲线Fig.1 Calcium ion standard curve

2.3 单因素实验的虾壳脱钙效果

2.3.1葡萄糖酸浓度对虾壳脱钙效果的影响 由图2 可知，脱钙率随着葡萄糖酸浓度的增加迅速上升，当葡萄糖酸浓度为0.4 mol/L 时，脱钙率达到91.21%，是低浓度（0.1 mol/L）的4.5 倍，表明葡萄糖酸浓度对虾壳脱钙具有显著影响作用。这主要归因于浓度增加，提高了整个酸浸体系中反应底物的浓度，促进葡萄糖酸钙的生成，进而提升了脱钙效率。但当酸浓度增加到0.5 mol/L 时，虾壳脱钙率基本不发生变化，反应趋于平衡，因此选取葡萄糖酸浓度为0.4 mol/L 比较适合。

图2 葡萄糖酸浓度对虾壳脱钙效果的影响Fig.2 Effects of gluconic acid concentration on decalcification rate

2.3.2反应温度对虾壳脱钙效果的影响 由图3 可知，在25～ 30 ℃范围内，虾壳脱钙率随着温度上升而增加。在30 ℃时，虾壳脱钙率为91.21%；而当温度超过30 ℃，脱钙率基本不发生太大变化。这主要由于较高温度，会降低CO2的溶解度，大量上升气泡会黏附虾壳粉颗粒浮到表面，进而影响葡萄糖酸的脱钙效果。综合考虑脱钙率和能耗，确定最佳虾壳脱钙反应温度为30 ℃。

图3 反应温度对虾壳脱钙效果的影响Fig.3 Effects of reaction temperature on decalcification rate

2.3.3反应时间对虾壳脱钙效果的影响 由图4 可知，在2.0 h 以内，脱钙率随着反应时间延长而迅速增大。当反应时间为2.0 h，对应脱钙率为91.21%；而当反应时间继续延长至2.5 h，脱钙率仅增长0.17%。这主要是因为增加反应时间，有利于葡萄糖酸分子与虾壳中钙组分进行充分反应，产生葡萄糖酸钙。但当反应达到一定时间后，虾壳的钙组分浓度大大减低，葡萄糖酸钙的生成效率逐渐减小，最后脱钙率趋于稳定。因此，选择2.0 h 作为最佳脱钙反应时间。

图4 反应时间对虾壳脱钙效果的影响Fig.4 Effects of reaction time on decalcification rate

另外，虾壳的酸浸脱钙反应是典型的固液反应，其中碳酸钙组分与葡萄糖酸的反应较迅速，钙的溶出动力学主要受扩散传质的控制，扩散传质是产生的Ca2+通过液膜层或固膜层。如果酸浸脱钙反应受固膜扩散控制，虾壳脱钙率和反应时间的关系可以用浸出动力学公式：1 -(2/3)N–(1–N)2/3=kt来表示[19]，其中N为虾壳脱钙率，k为反应速率常数，t为反应时间。而钙的溶出动力学可以用收缩核模型理论进行描述，即在酸浸脱钙过程中，由于葡萄糖酸作用，使得固体钙组分以Ca2+形式从浓相（固相）扩散到淡相（液相）中，该扩散过程发生在固液两相界面。

以1-(2/3)N-(1-N)2/3对反应时间t作图，钙的固膜扩散收缩核动力学模型如图5 所示。动力学数据表明，葡萄糖酸的虾壳脱钙过程符合固膜扩散收缩核动力学模型，对应的拟合方程线性相关性高，相关系数R2=0.942。

图5 虾壳脱钙的固膜扩散收缩核动力学模型Fig.5 Solid film diffusion shrinkage core dynamics model for decalcification of shrimp shells

2.3.4料液比对虾壳脱钙效果的影响 由图6 可知，当料液比小于1∶20 时，脱钙率随着料液葡萄糖酸与虾壳粉的接触面积，从而改善了脱钙效果。当料液比超过1∶20 时，脱钙率反而有所减低，可能是虾壳中钙组分已对葡萄糖酸达到饱和状态，过高的料液比无法有效提升虾壳脱钙效果[20]。因此确定最佳料液比为1∶20。

图6 料液比对虾壳脱钙效果的影响Fig.6 Effects of solid-liquid ratio on decalcification rate

2.4 均匀设计实验的虾壳脱钙效果

均匀设计实验是一种集数论原理和多元统计的多因素多水平的实验设计方法，与全面实验和正交实验设计相比，其最大优点是通过少数实验次数完成整个实验周期[21-22]。本实验涉及4 个因素，每个因素有5 个水平，选用均匀设计实验U10*(54)，仅需要10 组实验；若采用正交实验，则需要用L25(54)表，做25 组实验。通过DPS 7.05 软件对均匀设计实验数据进行线性回归分析，依据回归方程对脱钙率进行预测，确定最佳理论反应条件。

为综合考虑各因素对虾壳脱钙效果的影响，在单因素实验的基础上进行均匀实验设计。选取推荐用表选择第1、3、4、5 列，形成拟水平设计表，为方便拟合，对料液比进行换算，如表1 所示。从均匀实验结果可知，实验4（A1=0.05 g/mL，A2=25 ℃，A3=1.5 h，A4=0.5 mol/L）的脱钙率最高，为92.1%。通过DPS 7.05 软件分析，得到多元一次线性回归方程：

表1 均匀设计试验结果Table 1 Uniform design tests results

经方差分析得知，F=20.80、P=0.003 1 ＜ 0.01、复相关系数R为0.966 4，回归关系极显著，表明A1（料液比）、A2（反应温度）、A3（反应时间）、A4（酸浓度）与虾壳脱钙率呈极显著的回归关系。

从回归方程可知，A1、A2的系数为负，表明实验指标随着因素A1、A2的增加而减小；而A3、A4的系数为正，表明实验指标随着因素A3、A4的增加而增大。因此，在确定最佳理论工艺参数时，因素A1、A2应取偏下限，即料液比为0.04（1∶25）g/mL，反应温度为25 ℃；因素A3、A4应取偏上限，即反应时间为2.5 h、酸浓度为0.5 mol/L，将以上各值带入式（3），得到Y=93.45%，这一结果要优于表1 中10 个实验结果。另外，从公式（3）可知，A1、A2、A3、A4的系数分别为-424.564、-0.751、2.519和122.308，其中A1、A3、A4具有较大系数，表明A1、A3、A4的变化对Y值影响较大，为主要影响因素，这与2.3 的单因素实验结果是一致的；A2的系数较小，表明A2的变化对Y值影响较小，为次要影响因素，与图3 的结果一致，进一步验证了多元一次线性回归方程的可靠性。

2.5 不同反应条件对虾壳脱钙效果影响对比

根据式（3）得到的最佳反应条件，与单因素确定的最佳条件和均匀设计实验的最佳条件进行验证实验对比，结果如图7 所示。可以看出，单因素最佳条件1(0.05 g/mL、30 ℃、2.0 h、0.4 mol/L)下的虾壳脱钙率为（91.21 ± 0.40）%，均匀设计实验最佳条件2（A1=0.05 g/mL，A2=25 ℃，A3=1.5 h，A4=0.5 mol/L）下的虾壳脱钙率为（92.1 ± 0.21）%,而由回归方程预测到的最佳反应条件3 的脱钙率则高达（93.78 ± 0.36）%,其结果优于单因素考察最佳条件和均匀设计实验最佳条件，同时该实验结果也优于已有文献报道。如于会国等[23]利用乳酸杆菌发酵对虾壳脱钙，选取发酵温度37 ℃，反应时间72 h，虾壳的脱钙率仅为80.35%；李明华等[18]在超声波辅助条件下优化了柠檬酸脱钙工艺，选定温度50 ℃,反应时间 1.5 h，对应的虾壳脱钙率为93.85%。通过对比反应条件可知，本研究采用该线性回归模型优化的工艺条件相对温和，反应时间适中，操作简单，更具有实用价值。

图7 不同反应条件对虾壳脱钙效果的影响Fig.7 Effects of different reaction condition on decalcification rate

2.6 葡萄糖酸钙的红外光谱图

为进一步验证葡萄糖酸直接虾壳脱钙一步法制备葡萄糖酸钙可行性，将制得脱钙液经冷冻干燥后，与溴化钾混匀压片进行红外光谱分析，结果如图8(a)所示。其中3 200～ 3 400 cm-1处较宽的吸收峰对应—OH 的伸缩振动吸收；2 938 cm-1为—CH2—的伸缩振动吸收峰；1 596 cm-1、1 437 cm-1为羧酸盐的—COO-的伸缩振动吸收峰；1 140 cm-1、1 051 cm-1为C—OH 的伸缩振动吸收峰。通过图谱对比，制得样品的谱图与葡萄糖酸钙标准红外谱图[10]（图8(b)）是一致的。此外，通过元素分析结果（表2）可知，葡萄糖酸钙的各元素比例与理论值基本一致，表明制备的葡萄糖酸钙具有较好的纯度，这也侧面证明了通过葡萄糖酸直接虾壳脱钙一步法制备葡萄糖酸钙是可行的。

图8 样品和葡萄糖酸钙的红外光谱Fig.8 The infrared spectrum of as-made sample and calcium gluconate

表2 样品与葡萄糖酸钙样品的理论元素含量对比Table 2 Elemental analysis of as-made sample and calcium gluconate

3 结论

葡萄糖酸对虾壳具有良好的脱钙效果，通过单因素实验及均匀设计实验，获得虾壳脱钙的最佳反应条件，即料液比为1∶25 (g/mL)，葡萄糖酸浓度为0.5 mol/L，在25 ℃反应2.5 h，虾壳的脱钙率高达（93.78 ± 0.36）%，该脱钙过程符合固膜扩散收缩核动力学模型。此外红外结果和元素分析结果也表明，利用葡萄糖酸一步法制备的葡萄糖酸钙具有较好的纯度。该工艺反应条件温和、操作简便、节能低耗，比较符合绿色环保的理念，可为开展虾壳的资源化利用提供新思路和理论借鉴。