热处理对罗非鱼分离蛋白乳液稳定性的影响

陈艾霖，刘 璐，宋春勇，冯 瑞，洪鹏志,2，周春霞,2，林玉锋

（1.广东海洋大学食品科技学院// 广东省水产品加工与安全重点实验室// 广东省海洋食品工程技术研究中心，广东 湛江，524088；2.南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江），广东 湛江，524025）

乳液一般由连续相、分散相和乳化剂三部分组成，是两种互不相溶的液体混合，需要借助乳化剂形成均匀的分散体[1]。蛋白质对环境污染小，可再生且具有表面活性，一般作为可食用乳化剂广泛应用在食品加工中[2]。常用的蛋白质乳化剂主要包括乳蛋白[3-4]和植物蛋白[5-6]。与陆地植物蛋白和乳蛋白相比，鱼类蛋白具有必需氨基酸种类齐全、比例均衡、消化吸收率高等优点[7]。有研究表明，鱼类蛋白能够阻止油滴絮凝和抑制乳液脂质氧化，可作为一种潜在的乳化剂[8]。目前对罗非鱼（Oreochromis niloticus）的研究主要集中在鱼片冷冻贮藏[9]和干燥[10]、蛋白的提取和性质改善[11]以及鱼糜凝胶特性[12]等方面，其分离蛋白作为乳化剂在实际应用中极少，主要与罗非鱼分离蛋白分子量大、溶解度较低以及稳定性差、加工贮藏过程中极易发生变性[13]有关。

蛋白质乳液稳定性受多种pH 值、离子强度和加工条件等[14]因素影响。热处理是食品加工过程必不可少的手段，中性条件下的食品乳液必须经过热处理，才能获得相应的保质期[15]。研究表明，热处理能诱导蛋白质分子具有更灵活的界面构象和较高的游离巯基基团[16]。30 ℃和50 ℃热处理使大豆油脂体乳液表面蛋白分子部分疏水性基团暴露，提高油脂体表面蛋白在油-水界面的吸附，增加乳液的界面强度[17]。Ma 等[2]发现热处理能促进鳕（Gadus macrocephalus）鱼蛋白的界面吸附，使乳液粒径减小，乳化性能改善。周春霞等[11]通过添加十二烷基硫酸钠，发现静电和疏水相互作用结合导致肌球蛋白纤丝解离，可改善低离子强度下肌球蛋白的热聚集。刘慧清[18]发现，罗非鱼分离蛋白（tilapia protein isolate，TPI）在碱性条件下也可以乳化花生油制备稳定的乳液。目前国内外尚没有关于热处理是否可以改善TPI 乳液稳定性的相关报道。因此，本研究以TPI 为乳化剂，通过高压均质制备O/W 型TPI乳液，探讨热处理（60～ 90 ℃，30 min）对乳液稳定性的影响，为制备稳定的鱼蛋白乳液及热处理在乳液食品体系中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要的实验材料 罗非鱼，湛江东风市场；玉米油，益海嘉里有限公司；尼罗红，上海麦克林生化科技有限公司；尼罗蓝，SIGMA 试剂公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2主要仪器设备 Avanti J-26sxp 落地高速冷冻离心机：美国Beckman 公司；VAP-450 自动凯氏定氮仪：德国Gerhardf 公司；ALPHA1-2LD plus冷冻干燥机：德国Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen 公司；高压纳米均质机：加拿大ATS 仪器公司；DF-101S 恒温水浴锅：河南省予华仪器有限公司；NanoBrook Omni 激光粒度及zeta 电位仪：美国布鲁克海文仪器公司；MARSIII模块化高级流变仪：Thermo 仪器公司；FV3000 激光扫描共聚焦显微镜：奥林巴斯仪器公司。

1.2 方法

1.2.1TPI 的提取 取鲜活罗非鱼背部白肉绞碎，按照质量比1∶9 与冰蒸馏水混合，用匀浆机搅拌3 min，用1 mol/L NaOH 调节pH 值至11.0，磁力搅拌提取15 min 后离心（10 000 r/min、20 min、4 ℃）。将离心后的上清液通过8 层纱布过滤，过滤后的滤液用1 mol/L HCl 调节过滤液pH 值至5.5，再离心（10 000 r/min、20 min、4 ℃）。用冰蒸馏水分散离心所得的蛋白沉淀，pH 值调至7.0，透析后冷冻干燥成蛋白粉末备用。参考GB5009.5-2016 测TPI的粗蛋白质质量分数为（96.05±0.76）%。

1.2.2乳液的制备 将TPI 粉末分散到冰蒸馏水中配制质量分数为1.0%的溶液，冰水浴下用磁力搅拌器搅拌2 h 使之完全溶解，调整TPI 溶液的pH 为7.0。将TPI 蛋白溶液与玉米油按质量比9∶1 比例混合，12 000 r/min 高速剪切2 min 获得粗乳液。粗乳液于60 MPa、4 ℃高压均质5 次获得细乳液。新制备的乳液分别置于60、70、80、90 ℃的水浴锅，放进水浴锅后计时加热30 min，冷却至室温，对照组不加热，所有样品储藏存于4 ℃进行乳液稳定性测定。

1.2.3粒径和电位的测定 将新鲜制备的乳液稀释300 倍避免多重散射，利用激光粒度及zeta 电位仪测定不同温度处理后乳液的粒径和电位。TPI 乳液于4 ℃贮藏28 d，每7 d 取样测定其平均粒径。

1.2.4黏度的测定 取2 mL TPI 乳液于间隔为1 mm、探头型号P35TiL、直径60 mm 的平行板上，温度设定在25 ℃，测定0.1～ 100 s-1的剪切速率对乳液的黏度影响，记录乳液的初始黏度。

1.2.5乳析指数的测定 乳析指数是一个直观反映乳液稳定性和蛋白质乳化能力的参数。根据Surh等[19]的方法略有改动测定TPI 乳液的乳析指数。将乳液密封于50 mL 玻璃瓶中（内径2.5 cm，高度6.0 cm），4 ℃保存。测定乳液储存28 d 的乳析情况和实物图拍照。记录乳液析出清液层的高度（Hs）和乳液总高度（Ht），乳析指数（CI）计算公式如下：

1.2.6微观结构的测定 参考Liu 等[20]的方法进行测定。分别取不同热处理的TPI 乳液30 μL 于离心管中，同时加入10 μL 质量分数0.1%的尼罗红染液（甲醇溶解）和10 μL 质量分数1%尼罗蓝染液（蒸馏水溶解），在暗处反应15 min 后取10 μL 混合液于载玻片上，盖上盖玻片，利用激光扫描共聚焦显微镜在100 × 油镜下观察，拍照分辨率为1 024× 1 024。尼罗蓝染料对蛋白质进行染色（在激发波长为633 nm 和检测波长618～ 710 nm 发射波长的激光下）观察，尼罗红染料对油滴进行染色（在激发波长488 nm 和检测波长580～ 620 nm 下）观察。

1.3 数据统计分析

实验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。数据使用Origin 9.0 软件作图，数据间的显著性差异采用 SPSS Statistics 24.0 软件进行方差分析（ANOVA），并且通过Duncan 法检验平均值间的显著性，显著性水平α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 热处理对TPI 乳液电位和黏度的影响

由表1 可知，未经热处理的TPI 乳液表面电位值为（-18.55±1.26）mV，经热处理后，TPI 乳液带负电荷不变且电位的绝对值均显著增加（P＜0.05）。随着加热温度的升高，乳液表面电荷绝对值呈先增加后减少的趋势，经70 ℃热处理的TPI 乳液电位绝对值最大。这可能是因为乳液经热处理后油-水界面的蛋白质分子结构展开，分子内部带电基团和氨基酸残基暴露[16]，界面蛋白质的表面净电荷增加。乳液界面蛋白电荷量的增加，液滴之间的静电斥力增加[21]，从而防止液滴聚集，形成更稳定的乳液体系。ZHAO 等[22]发现，谷蛋白经100 ℃加热60 min 后，蛋白质表面净电荷增大，蛋白聚集体柔性增加，与本研究结果一致。Zeta 电位是表征蛋白质表面电荷量，与油滴间的静电排斥力和相互吸引力有关，可作为乳液体系潜在稳定性的指标[23]。乳液的稳定性与水油界面处蛋白膜的柔性有关，疏水性和带电性氨基酸的暴露提高蛋白质分子的柔性，进而影响蛋白质的功能性质[24]。

表1 热处理对TPI 乳液黏度的影响Table 1 Effect of heat treatment on viscosity of TPI emulsion

加热处理后TPI 乳液黏度显著增强（P＜ 0.05），其中70 ℃热处理的乳液表面净电荷最高，对应的黏度最大。表1 表明黏度和zeta 电位在某种程度上具有一定的相关性，通过皮尔逊相关性的分析，黏度和电位的相关性系数值为0.666，较高的静电排斥力对液体流动的阻力更大[20]。乳液油水界面黏度与液滴发生絮凝时间相关，界面黏度越大，界面强度越大[25]，形成的乳液也越稳定。热处理导致TPI中肌球蛋白的螺旋结构解开，尾部丝状交联形成小聚集体[2]，界面蛋白紧密结合，在油滴表面形成蛋白膜，油水界面处蛋白质的相互作用增加乳液的黏度[26]。其次热处理会使界面蛋白分子部分疏水性基团暴露[27]，油滴与蛋白质之间的结合作用强，界面处的蛋白质分子之间或蛋白质与油滴之间的疏水相互作用结合稳定，在剪切力的作用下仍然具有很高的黏度。

2.2 热处理对TPI 乳液粒径的影响

对TPI 乳液热处理后其乳液粒径的变化如图1所示。未经热处理的TPI 乳液的初始粒径为（643.36±38.53）nm，60～ 80 ℃热处理后TPI 乳液的初始粒径显著性减小（P＜ 0.05），其中70 ℃热处理30 min 后的TPI 乳液的粒径最小（507.21±7.98）nm。这可能是因为一方面加热过程中，疏松的乳液聚集体被分散为更小的液滴，加上液滴表面净电荷增加，液滴在静电斥力的作用下不易聚集[28]；另一方面热处理使蛋白质发生亚基的解离和分子的伸展，将原来被掩盖的一些非极性基团暴露在界面，疏水性增加，界面张力减小，蛋白质与油滴结合作用增强，乳液液滴粒径减小，稳定性增强[17]。乳液液滴大小影响乳液的絮凝和聚集，液滴越小，聚集和絮凝越慢，乳液分层所需时间越长[29]。而90 ℃处理后乳液粒径减小不明显（P＞ 0.05），可能是因为当温度达90 ℃后，氨基酸残基与其他分子通过氢键和二硫键作用形成聚集体[30]。4 ℃条件下，未经热处理的TPI 乳液贮藏7 d 粒径迅速增大（P＜ 0.05），之后粒径变化不明显，这是因为对照组乳液初始粒径较大，液滴在重力作用和布朗运动作用下聚集速度快[14]。热处理后的乳液在储藏过程中粒径缓慢增加，70 ℃加热的TPI 乳液粒径变化最小，可能是乳液加热后黏度增加，以致液滴的空间位阻增大，降低了碰撞频率。其中70 ℃热处理的TPI 乳液黏度最大，液滴聚集速度慢，说明乳液稳定性最好。

图1 热处理对TPI 乳液粒径的影响Fig.1 Effect of heat treatment on the particle size of TPI emulsion

2.3 热处理对TPI 乳液乳析指数的影响

图2 和图3 分别是热处理后TPI 乳液4 ℃静置28 d 的乳析指数和直观图。由图可知，未经热处理的TPI 乳液贮藏至5 d 出现乳液析出现象，7 d 底部明显析出水层，28 d 乳液乳析指数达（16.11±1.28）%，说明乳液不稳定。乳液中油滴和水相发生相分离的快慢与液滴大小和液滴发生聚集的速度有关[32]。较大颗粒的液滴比较小的液滴移动更快，发生聚集的现象就越明显，因此对照组的乳液粒径大，液滴易聚集，从而出现分层现象。乳液分层是由两相密度差异引起的，较大的油滴向上移动以致乳液底部析出水层，乳析指数高代表乳液稳定性差[31]。60～ 90 ℃热处理的TPI 乳液储存28 d 仍保持稳定，无分层现象。可能是因为乳液加热后黏度增加，以致液滴的空间位阻增大，降低了碰撞频率。其中70 ℃热处理的TPI 乳液黏度最大，液滴聚集慢，另一方面也可能是因为液滴表面带同种电荷数量增加，液滴之间的静电斥力增加，减少相互聚集。此结果再一次证明，热处理能够改善TPI 乳液的稳定性，延长乳液的贮藏期。

图2 热处理对TPI 乳液乳析指数的影响Fig.2 Effect of heat treatment on creaming index of TPI emulsion

图3 TPI 乳液贮藏过程直观显示Fig.3 Visual appearance of TPI emulsion during storage

2.4 热处理对乳液微观结构的影响

热处理对乳液微观结构的影响如图4 所示。TPI乳液的蛋白质经尼罗蓝染料染色后呈绿色，油滴经尼罗红染料染色后呈红色。乳液液滴基本是呈现球状，且蛋白质成功包裹在油滴外部。未经热处理的TPI 乳液液滴聚结，颗粒较大且不规则。乳液的絮凝和聚集速率与油滴的分布情况和大小有关，可通过光共聚焦对其微观结构进行观察[2]。60 ℃和70 ℃热处理30 min 后明显看出TPI 液滴粒径减小且分布均匀，而80 ℃和90 ℃热处理后乳液部分液滴又发生聚结和絮凝。这个结果与粒径随着热处理温度的增加，乳液粒径先减小后增大的结果一致，说明一定程度的热处理可能导致乳液油-水界面的张力下降，促进更小的液滴产生，液滴的表面增加，乳液黏度增大。同时，乳液表面净电荷增加，液滴之间净电斥力增大，液滴不易聚集。而当加热温度过高时，乳液失去抗聚结的能力，蛋白结构过度展开而聚结成大颗粒[33]。热处理温度过高导致乳液液滴之间相互作用形成的聚集体比未经热处理的乳液聚集体更加稳定，因此80 ℃和90 ℃热处理的乳液贮藏过程未发生分层。综上，热处理能够改善TPI 乳液的储存稳定性。

图4 热处理对TPI 乳液微观结构的影响Fig.4 Effect of heat treatment on microstructure of TPI emulsion

3 结论

热处理（60、70、80、90 ℃加热30 min）过程中界面蛋白结构展开，内部基团暴露，分子之间相互作用增强，乳液的表面净电荷和黏度显著增大（P＜ 0.05），延缓液滴的絮凝和聚结以及延长乳液贮藏时间。其中，TPI 乳液经70 ℃加热30 min 效果最佳，乳液粒径最小为（507.21±7.98）nm，激光共聚焦显微镜下观察乳液液滴较小且分布均匀，乳液稳定性好且贮藏28 d 未分层。热处理能够有效改善TPI 乳液的稳定性，控制温度可改变乳液的粒径和黏度。