高效液相色谱一测多评法同时测定益肺胶囊中苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的含量

邵 艳，黄 英，浦锦宝

（1.杭州市萧山区中医院药剂科，浙江 杭州 311201；2.杭州市萧山区中医院推拿科，浙江 杭州 311201；3.浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007）

益肺胶囊是由炒苦杏仁、知母、桑白皮等8味中药加工而成，用于久病咳喘、胸满多痰等病症的治疗，现行质量标准[1]和文献报道[2-3]仅对该制剂单一成分进行定量控制，难以全面体现中成药复方制剂多成分-多靶点-多通道相互作用的整体特点和质控要求。笔者依据中药配伍基础理论，结合中药质量标志物新概念，采用高效液相色谱一测多评法，对益肺胶囊中君药炒苦杏仁特征成分苦杏仁苷，臣药知母主要药效成分新芒果苷、芒果苷和异芒果苷，佐药桑白皮代表性成分桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素含量同时测定，建立益肺胶囊多指标成分质量控制方法，以期为全面评价益肺胶囊的整体质量提供数据参考。

1 仪器与试药

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），LC-2010A型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），AG-135型电子天平（德国Mettler Toledo公司），KEL-600型数控超声波清洗机（济南克林自动化设备有限公司）。对照品苦杏仁苷（批号：110820-201808）和芒果苷（批号：111607-201704）来源于中国食品药品检定研究院；对照品新芒果苷（批号：PRF9070941）和异芒果苷（批号：PRF9092642）来源于成都普瑞法科技开发有限公司；对照品桑皮苷A（批号：CFS202001）、桑辛素M（批号：CFS201901）和二氢桑色素（批号：CFS201902）来源于武汉天植生物技术有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；益肺胶囊（山西华元医药生物技术有限公司，规格：0.3 g，批号：190101、190201、190401、190402、190702、190901、190902、190903、191202、200302）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 取苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素对照品适量，精密称定，用稀乙醇溶解并制成质量浓度分别为9.532、4.878、2.594、0.228、0.306、0.192、0.116 mg·mL-1的混合贮备液；精密量取上述贮备液1.0 mL，用稀乙醇稀释至20 mL，制得质量浓度分别为476.6、243.9、129.7、11.4、15.3、9.6、5.8 µg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取益肺胶囊10粒，倾出内容物，研成细粉，取2.0 g精密称定，加稀乙醇20 mL，超声30 min，放冷后用稀乙醇稀释至25 mL，摇匀，过滤，得益肺胶囊供试品溶液。取适量按益肺胶囊质量标准处方比例及工艺制备缺炒苦杏仁、缺知母、缺桑白皮的阴性供试品，按上述方法制备阴性供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性实验

流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～ 10 min，8.0%A；11 ～ 16 min，8.0%→12.0%A；17 ～ 27 min，12.0%→23.0%A；28 ～ 44 min，23.0%→65.0%A；45 ～ 50 min，65.0%→8.0%A），流速：1.0 mL·min-1；色谱柱：UltiMate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：30 ℃；检测波长分别为207 nm（0 ～ 16 min检测苦杏仁苷）[4-5]、258 nm（17 ～ 27 min检测新芒果苷、芒果苷和异芒果苷）[6-8]和305 nm（28～ 50 min检测桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素）[9]；进样量：10 µL。理论塔板数以各成分色谱峰计应≥4500。

2.3 专属性考察

分别精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液及“2.1.2”项下溶液各10 µL，按“2.2”项下色谱条件进样检测分析，记录所检测色谱图（见图1）。结果显示，混合对照品和益肺胶囊供试品色谱图中苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素与相邻色谱峰均能良好分离，分离度均> 1.5；阴性供试品对益肺胶囊中7种成分的同时测定无干扰。

图1 HPLC色谱图1 - 苦杏仁苷，2 - 新芒果苷，3 - 芒果苷，4 - 异芒果苷，5 - 桑皮苷A，6 - 桑辛素M，7 - 二氢桑色素；A - 混合对照品，B - 益肺胶囊，C -苦杏仁阴性供试品，D - 知母阴性供试品，E - 桑白皮阴性供试品Fig 1 HPLC chromatogram1 - amygdalin, 2 - neomangiferin, 3 - mangiferin, 4 - isomangiferin, 5 -mulberroside A, 6 - moracin M, 7 - dihydromorin; A - mixed control, B -Yifei capsules, C - sample without of semen armeniacae amarae, D - sample without of rhizoma anemarrhenae, E - sample without of mori cortex

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系 精密量取“2.1.1”项下贮备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别用稀乙醇稀释至20 mL，制得系列浓度溶液，各精密吸取10 µL，按“2.2”项下色谱条件进样检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积，以峰面积对质量浓度进行线性回归，计算得7种成分的回归方程和线性范围，见表1。

表1 回归方程和线性范围Tab 1 The results of regression equation and linear range

2.4.2 精密度 取益肺胶囊（批号：190101）同一份供试品溶液，精密吸取10 µL注入高效液相色谱仪中，检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积，重复进样6次，测得益肺胶囊中7种成分峰面积的RSD分别为0.52%、0.66%、0.83%、1.18%、0.91%、0.87%、1.24%。

2.4.3 重复性 取益肺胶囊（批号：190101）供试品适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，重复操作6次，进样检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积，计算得7种成分含量的RSD分别为0.74%、0.89%、1.25%、1.88%、1.73%、1.60%、1.89%。

2.4.4 稳定性 取益肺胶囊（批号：190101）同一份供试品溶液，于制备后0、4、8、12、16、20、24 h各进样10 µL，检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积，结果显示供试品溶液24 h内稳定，7种成分峰面积的RSD分别为0.56%、0.61%、0.90%、1.21%、1.03%、0.95%、1.28%。

2.4.5 加样回收率 取含量已知的益肺胶囊供试品（批号：190101）适量，内容物研成细粉，取9份，每份1.0 g，精密称定，分别加入混合对照品溶液（苦杏仁苷3.472 mg·mL-1、新芒果苷1.847 mg·mL-1、芒果苷0.914 mg·mL-1、异芒果苷0.081 mg·mL-1、桑皮苷A 0.104 mg·mL-1、桑辛素M 0.067 mg·mL-1、二氢桑色素0.039 mg·mL-1）1.0、2.0、3.0 mL各3份，按照“2.1.2”项下方法制备加样供试品溶液，精密吸取上述溶液各10 µL，注入高效液相色谱仪中，检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积并计算各成分加样回收率。结果显示，益肺胶囊中7种成分的平均加样回收率及RSD分别为100.08%（0.61%）、99.66%（0.83%）、98.95%（0.95%）、98.48%（1.47%）、97.82%（1.08%）、96.91%（1.16%）、97.89%（1.57%）。

2.4.6 相对校正因子的测定 精密吸取“2.4.1”项下系列浓度溶液各10 µL，进样检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积，以芒果苷为内参物，按计算公式：ƒk/s= ƒk/ƒs=（WkAs）/（WsAk）（公式中W、A分别代表质量浓度和峰面积，k、s分别代表其他成分和内参物）分别计算得苦杏仁苷、新芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素相对校正因子，见表2。

表2 相对校正因子结果Tab 2 Results of relative correction factors

2.4.7 相对校正因子耐用性考察 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液10 µL，进样检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积，对比考察不同仪器、色谱柱、柱温以及流速对相对校正因子的影响，结果显示在不同仪器（UltiMate 3000型、LC-2010A型高效液相色谱仪）和色谱柱（UltiMate AQ-C18柱、Agilent TC-C18柱、Thermo C18柱）条件下苦杏仁苷、新芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素相对校正因子分别为1.473 1、1.258 6、0.736 3、0.696 8、0.816 7、0.934 9，RSD分别为1.35%、1.89%、1.44%、1.15%、1.53%、1.49%；在不同柱温（25、28、30、32、35 ℃）条件下各成分相对校正因子分别为1.475 9、1.266 4、0.742 1、0.702 1、0.817 8、0.935 6，RSD分别为1.18%、1.84%、1.51%、1.01%、1.45%、1.09%；在不同流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1）条件下各成分相对校正因子分别为1.477 5、1.259 1、0.735 8、0.695 4、0.815 1、0.936 0，RSD分别为1.86%、1.61%、1.66%、1.03%、1.71%、1.53%。表明本实验所建立的相对校正因子耐用性良好。

2.5 一测多评法与外标法测定结果比较

取10个批次的益肺胶囊样品适量，按“2.1.2”项下方法每批次平行制备3份益肺胶囊供试品溶液，精密吸取10 µL注入高效液相色谱仪中，按“2.2”项下色谱条件进样检测苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素的峰面积，采用外标法（external standard method，ESM）和一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker method，QAMS）分别计算7种成分的含量，见表3。

表3 含量测定结果. mg·g-1，n = 3Tab 3 Results of content determination. mg·g-1, n = 3

3 讨论

3.1 指标成分的选择

益肺胶囊由炒苦杏仁、知母、桑白皮、红参、茯苓、川贝母、甘草和蛤蚧8味中药按照君、臣、佐、使配伍而成，方中炒苦杏仁降气、止咳、平喘，蛤蚧补肺益肾、纳气定喘，合为君药；知母清热泻火、滋阴润燥，川贝母清热润肺、化痰止咳，红参补气固脱、益气摄血，合为臣药；桑白皮泻肺平喘，茯苓利水渗湿、健脾宁心，合为佐药；甘草补脾益气、祛痰止咳、调和诸药，为其使药[10]。8味中药材所含成分相互协同、相互制约，共达补肾益肺、清热化痰、止咳平喘的临床功效。笔者参考中药质量标志物确认原则，选择君药炒苦杏仁特征成分苦杏仁苷，臣药知母主要药效成分新芒果苷、芒果苷和异芒果苷，佐药桑白皮代表性成分桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素为定量控制指标成分，以期为全面评价益肺胶囊的整体质量提供数据支持。

3.2 供试品溶液提取方法筛选

本实验在对益肺胶囊样品提取过程中分别考察了95%乙醇、稀乙醇[7]、50%甲醇[5]、甲醇[4]、水[9]等溶剂对苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M、二氢桑色素综合提取率的影响，结果表明以稀乙醇为提取溶剂时，益肺胶囊中7种成分综合提取率最佳，杂质干扰较小，基线相对平稳。遂对提取方式（超声提取[4-8]、回流提取[9]）及提取时间进行对比优化，结果显示两种方法提取7种成分效果无明显差异，但超声提取杂质干扰较小，更易于操作且稳定。最终确定以稀乙醇为提取溶剂超声提取30 min对益肺胶囊进行供试品处理。

3.3 流动相的优化

以益肺胶囊中7种成分峰形和分离度为主要评价指标，考虑到甲醇在低波长处存在紫外吸收，影响色谱图基线平稳及定量检测准确性，故选用乙腈为有机相，对不同流动相体系（乙腈-1%冰醋酸溶液[6-7]、乙腈-0.1%甲酸溶液[8]、乙腈-0.1%磷酸水溶液[4-5]、乙腈-0.2%磷酸水溶液）进行对比考察，同时对有机相和水相比例进行不断优化，最终确定“2.2”项下流动相体系。

从含量测定结果来看，一测多评法计算结果与外标法实测值之间无明显差异，表明本文所建立的高效液相色谱一测多评法可用于益肺胶囊多组分质量控制；同时检测结果也反映出各成分含量存在一定的批间差异，尤其以苦杏仁苷、异芒果苷和桑皮苷A差异较为明显，表明本文所建立的方法对确保益肺胶囊质量稳定性具有重要意义。本文采用高效液相色谱一测多评法对益肺胶囊中苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氢桑色素含量进行了同时测定，首次建立了益肺胶囊多指标成分质量控制模式，所建立的方法结果较准确，有效降低了检验成本，推动了方法的普及，为全面评价益肺胶囊整体质量提供了参考依据。