非小细胞肺癌EGFR罕见突变及其靶向与免疫治疗策略

冯惠仪，吴明玮

1 背景

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的激活突变发生在10%～20%的白种人和至少50%的亚洲非小细胞肺癌（NSCLC）患者中［1-3］。外显子19的缺失和外显子21的单个氨基酸取代L858R，通常称为“经典”EGFR突变，共同构成了NSCLC中EGFR突变的约85%，对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFRi）治疗敏感［4］。罕见突变占NSCLC中EGFR突变约15%，包括EGFR基因第18～25外显子内的点突变，缺失和插入突变［5］。每年全世界有30 000多名NSCLC患者新诊断携带罕见的EGFR突变。因此，了解罕见的EGFR突变的肿瘤特征并提供相应的临床治疗方案的选择具有重要的临床意义。但是，很少有临床试验能够系统地评估EGFRi在具有罕见EGFR突变的NSCLC患者中的疗效。由于临床数据的匮乏，该领域很大程度上依赖于临床试验和队列研究的事后汇总分析，以评估这一类患者中的EGFRi反应。例如，基于对LUX-Lung 2、LUX-Lung 3和LUX-Lung 6这三个临床试验的汇总分析的证据，FDA在2018年批准了第二代EGFRi阿法替尼用于治疗S768I、L861Q和G719X罕见EGFR点突变［6］。本文我们将详细阐述具有此类罕见的EGFR突变的患者的EGFRi反应的临床前和临床证据，为该类患者的临床治疗方案的选择提供参考。

图1 EGFR突变类型

2 EGFR18号外显子突变

最常见的EGFR突变发生在第19外显子中，而第18外显子突变较为罕见，占所有EGFR突变的4.1%［5］。18外显子突变包括以下几种情况。

2.1 E709X和外显子18缺失

E709的突变包括缺失delE709-T710insD（也称为外显子18缺失）和E709替代A、G、K或V的情况，其中E709K最常见。这些突变约占NSCLC中罕见EGFR突变的1.5%。在delE709-T710insD突变的基础上，超过75%在同一肿瘤中检测到其他EGFR突变，例如L858R，Ex19Del或G719X，E709氨基酸取代被，这些都称为“复合突变”［7，8］。

2.1.1 临床前研究为了研究E709X突变，目前针对罕见突变最完整的临床前研究是Kobayashi等人的研究。针对E709X突变，他们在Ba/F3和NIH-3T3细 胞 中 表 达E709K和delE709-T710insD［5］。E709X突变的Ba/F3细胞在缺乏IL-3的情况下生长，以及E709X突变的NIH-3T3细胞的成瘤能力增加，表明这些突变是致癌的驱动因素。为了了解这些突变的EGFRi敏感性，笔者使用7种不同的EGFRi对Ba/F3细胞进行了剂量反应实验。第一代抑制剂吉非替尼和厄洛替尼，第二代抑制剂阿法替尼、达科替尼和来那替尼，以及第三代抑制剂奥西替尼和罗西替尼。结果发现，与表达Ex19Del的Ba/F3细胞相比，E709K和delE709-T710insD对吉非替尼，厄洛替尼和奥西替尼的敏感性均显着降低，其中delE709-T710insD显示出对这些抑制剂的最大抗性。E709K和delE709-T710insD对第二代抑制剂阿法替尼和来那替尼的敏感性与Ex19Del相当。对表达E709K，delE709-T710insD和Ex19Del的HEK293细胞进行的蛋白质印迹分析表明，在用阿法替尼和来那替尼处理后，EGFR的活性在每种细胞系中均受到抑制。使用相同剂量的吉非替尼，厄洛替尼或奥西替尼治疗，抑制作用较小，表明与第一代或第三代抑制剂相比，第二代EGFRi对罕见突变E709X和外显子18缺失突变型EGFR具有最大的亲和力，提示临床治疗可能有效。

2.1.2 临床研究由于E709X替代和外显子18缺失突变的发生率较低，因此对这些患者的临床反应知之甚少。Kobayashi等［5］报道了15例E709X复合突变患者的53%反应率（response rate，RR），4例用第一代EGFRi治疗的delE709_T710insD患者的25%RR。该数据提示E709突变对第一代EGFRi总体更敏感。但在另一项研究中［6］，报道了一例52岁的女性，患有delE709_T710insD突变的双侧晚期肺腺癌，对阿法替尼治疗有明显的临床反应（time to treatment failure，TTF大于12个月）。以上研究病例数较少，且结果不一致，因此第二代EGFRi对于E709X突变是否更有效仍需进一步的临床数据支持。

2.2 G719X

G719X在NSCLC中罕见的EGFR突变中，G719X取代（包括G719S，G719A，G719C和G719D取代）是仅次于外显子20插入的较常见突变之一，约占NSCLC中所有EGFR突变的1.5%～3%［9］。G719X突变可以作为独立的EGFR突变发生，也可以与其他点突变（例如S768I或L819Q）组合存在。

2.2.1 临床前研究小林等［7］的研究表明，在体外表达G719A突变的Ba/F3细胞对第二代EGFRi的敏感性高于第一代EGFRi。他们发现，与表达Ex19Del的细胞相比，G719A对吉非替尼，厄洛替尼和奥西替尼的反应较差，而对第二代EGFRi阿法替尼和那拉替尼敏感，IC90分别为0.9 nM和1.1 nM。蛋白质印迹分析表明，使用高达1 μM的第一代或第三代EGFRi对G719A细胞进行处理，与使用10 nM阿法替尼处理的效果相当（即阿法替尼的IC50更低），使G719A突变细胞几乎完全丧失了EGFR活性。提示阿法替尼可能对G719A突变的肺癌有效，而第一代或第三代EGFRi可能疗效不佳。

2.2.2 临床研究Chiu等［8］人在针对罕见的EGFR突变的最大的临床研究中评估了吉非替尼和厄洛替尼在78个单一G719X突变患者与普通Ex19Del和L858R突变患者之间的疗效。尽管具有单个G719X突变的患者对第一代EGFRi治疗敏感（总缓解率（ORR）=36.8%，疾病控制率（DCR=72.4%，n=78），但与L858R突变相比（ORR=67.5%，DCR 50=95.6%，n=256）或Ex19Del（ORR 8=65.3%，DCR 9=94.5%，n=222）疗效较差。G719X患者的中位PFS为6.3个月，而L858R和Ex19Del患者的中位PFS为10～13个月。与临床前研究一致，在G719X患者中，第二代EGFRi已被证明比第一代抑制剂更有效。对来自LUX-Lung 2，LUX-Lung 3和LUX-Lung 6试验的32位患者的数据进行事后分析显示，阿法替尼抗罕见的EGFR突变型（G719X，S786I，L861Q）有临床疗效。在8个具有单个G719X突变的患者和6个具有复杂G719X突变的患者中，阿法替尼治疗有77.8%的RR和13.8个月的PFS，这在2018年1月使FDA扩大了阿法替尼的适应症，以包括具有G719X的NSCLC患者突变。最近的一项Ⅱ期临床试验表明，19名具有G179X突变的患者第三代抑制剂奥西替尼的RR为52.6%［9］。但是，与阿法替尼治疗相比，奥西替尼是否可以提供显着的生存获益，尚需进一步试验。

3 外显子20插入

EGFR外显子20插入突变涵盖1～7个氨基酸的异质插入范围，该插入范围发生在αC螺旋的C末端。在经典突变之后，EGFR外显子20插入是NSCLC中次常见的EGFR突变，据报道其发生率在所有观察到的EGFR突变中占4%～10%［10，11］。既往研究提示该类型突变可能会导致患者对TKI耐药。

3.1 临床前研究

EGFR外显子20插入突变体的晶体结构表明，外显子20插入形成了一个楔形物，会导致P环和αC螺旋结构发生结构变化，从而导致相对较小的药物结合口袋，从而在空间上阻碍第一代EGFRi的结合［12］或可“推动”αC螺旋并阻止其向外旋转为非活性构象，从而导致激酶结构域的组成性激活。因此，不同的EGFR外显子20插入突变显示出对EGFRi的不同敏感性。Yasuda等［15］发现A763_764insFQEA与第一代EGFRi吉非替尼具有高度亲和力，而D770_N771insNPG没有。临床前研究使用Ba/F3和NIH-3T3模型系统评估了5个外显子20插入突变对第二代EGFRi的敏感性，并指出达克替尼对于在770位包含甘氨酸残基的插入特别有效［15］。剂量反应实验也表明，只有表达D770delinsGY突变的细胞对达克替尼（17.5 nM）敏感。根据标准剂量每天1 mg给药后达克替尼的血浆浓度预测患者的药物敏感性仍在Ⅱ期试验中［16］。

另外一项研究表明，在使用CRISPR技术改造成可表达D770_N771insSVD或V769_D770InsASV插入的肺癌细胞系H2073细胞的异种移植模型中，奥西替尼具有显着的抗肿瘤活性［17］。

此外，在一项波齐替尼靶向外显子20插入突变能力的研究中，显示波齐替尼具有灵活的喹唑啉核心和小的连接基团，基于3D建模，已预测其紧密结合外显子20插入EGFR激酶的受限药物结合口袋［14］。Robichaux等［13］在Ba/F3细胞中表达了7种不同的EGFR外显子20插入突变，剂量反应实验表明，表达EGFR外显子20插入突变的细胞对低剂量的波齐替尼敏感。接受波齐替尼治疗后，突变型EGFR活性明显降低了，提示波齐替尼对外显子20插入的突变患者可能有效。

3.2 临床研究

携带EGFR外显子20插入片段的大多数NSCLC患者对第一代和第二代EGFRi均具有抗药性，报道的低应答率在0%～27%之间［18，19］。多个研究表明，对于携带A763_Y764insFQEA插入的患者，对厄洛替尼有部分反应，与传统的EGFR突变相比，其对第一代EGFRi的敏感性相似［20］。尽管目前获得许可的EGFRi并未显示对其他EGFR外显子20插入的患者有任何显着益处，但新兴的EGFRi（包括波齐替尼等）正在临床研究中，对于该亚组NSCLC患者可能有效［21］。

4 S768I

除插入第20外显子外，点突变S768I发生在EGFR基因第20外显子中编码αC螺旋的区域，据报道其频率为EGFR突变的0.6%～1%［5，22］。

4.1 临床前研究

Banno等［14］研究发现，与L858R突变相比，表达EGFR S768I的Ba/F3细胞对第一代和第三代EGFRi的敏感性较低。蛋白质印迹分析表明，表达S768I的Ba/F3s在用100 nM厄洛替尼或奥西替尼处理后仍然保留了EGFR活性，但用10 nM阿法替尼处理足以减少S768I EGFR的活性。Bann等［14］人研究了S768I的食道癌细胞系KYSE540，进一步证明S768I与L858R相比对第一代和第三代EGFRi有抗性，但对第二代EGFRi阿法替尼敏感。

4.2 临床研究

尽管S768I突变可以单独发生，但更常见的是S768I与EGFR中的其他点突变共同出现，形成复合突变。在对S768I突变患者的多个案例研究中，报告了对第一代EGFRi的反应差异很大［15］。Leventakos等［15］报道了4例孤立的S768I突变或S768I/G719X或S768I/L858R复合突变的患者在PFS从3到30个月不等。有趣的是，Chiu等［16］观察到，与单独的单个S768I点突变相比，复杂突变S768I/G719X对第一代EGFRi处理可能更敏感，复合S768I突变的RR为50%（n=10），而单个S768I突变33%RR（n=7）。在LUX-Lung 2，LUX-Lung 3和LUX-Lung 6试验的事后分析中，第二代EGFRi阿法替尼对8例S768I突变型NSCLC患者实现了100%ORR和14.7个月中位PFS，FDA因此批准该药物用于EGFR S768I突变的NSCLC患者。但是7/8的S768I突变患者中携带有G719X或L858R突变的复杂突变，仅1例患者具有单独S861I突变。因此，尚不清楚阿法替尼是否将对单S768I点突变的患者表现出一致的反应，因此，较大的队列研究正在进行。

5 L861Q

L861Q位于EGFR的激活环内，约占NSCLC中EGFR突变的3%［17］。

5.1 临床前研究

在Ba/F3模型系统中对L861Q的研究表明，与S768I突变相似，与L858R相比，L861Q对第一代EGFRi有抗性，但与S768I不同，L861Q对阿法替尼和奥西替尼均敏感［15］。蛋白质印迹分析显示在用厄洛替尼处理后，表达L861Q的细胞中EGFR活性得以保留，而在用10 nM阿法替尼或100 nM奥西替尼处理后，EGFR活性消失了。带有内源性EGFR L861Q突变的食道癌细胞系KYSE270也显示出与Ba/F3模型对阿法替尼或奥西替尼有类似的结果。这些数据表明第二代和第三代抑制剂都可能有效靶向L861Q突变。

5.2 临床研究

Chiu等［18］报道了57个L861Q突变患者的最大队列研究，观察到第一代EGFRi的RR为40%，即与L858R相比，L861Q突变对第一代EGFRi的敏感性降低。LUX-LUNG试验显示，阿法替尼治疗导致12例单L861Q点突变的患者，3例L861Q/G719X的患者和1例L861Q/Ex19Del复杂的突变的患者，RR为56%和8.2个月中位数。这些数据支持L861Q突变对阿法替尼敏感，因此FDA批准阿法替尼用于L861Q突变阳性NSCLC。奥西替尼的Ⅱ期临床试验报告了77.8%的L861Q突变患者（n=9）有部分反应［9］。这些数据支持临床前观察，即L861Q突变对第三代EGFRi敏感，并表明奥西替尼可能是具有L861Q突变的患者的有效治疗选择。

6 EGFR激酶结构域重复（EGFR-KDD）

EGFR-KDD最常见的是外显子18～25或外显子18～26的重复，它编码酪氨酸激酶结构域，尽管已经报道了外显子14～26和17～25重复的情况［19］。EGFR-KDD于2015年在NSCLC中首次被描述。两项多中心研究报告称EGFR-KDD的发生率分别为EGFR-KDD的0.2%（n=1010）［20］和0.24%（n=5394）［19］。突变的NSCLC患者，表明重复可能是肺癌中最罕见的EGFR突变类型之一。

6.1 临床前研究

与野生型EGFR相比，小鼠成纤维细胞系和Ba/F3细胞EGFR-KDD表现出高水平磷酸化。Gallant等还发现存在内源性EGFR-KDD的人胶质母细胞瘤细胞系A1235细胞在存在和不存在血清的情况下均表现出高水平的EGFR活性。为了研究EGFR-KDD对目前可用的EGFRi的敏感性，他们用厄洛替尼，阿法替尼和奥西替尼分别处理的表达EGFR-KDD的Ba/F3细胞，他们发现EGFR-KDD对阿法替尼最敏感。提示阿法替尼对于EGFR-KDD突变患者有潜在的临床疗效［21］。

6.2 临床研究

在Baik等人的病例报告中，携带EGFR-KDD的肺癌患者表现出对吉非替尼二线治疗持续6年的持久治疗反应。在化疗和培美曲塞治疗失败后后，用厄洛替尼作为四线治疗可以额外延长约3年的生存获益［22］。在另一例病例报告中，Gallant及其同事报道了一名患有NSCLC的EGFR-KDD患者，经过2个疗程的阿法替尼治疗后显示出部分反应［21］。

7 复合突变

在NSCLC中EGFR突变的情况下，术语“复杂”或“复合”可以指3种可能的情况：①经典L858R或Ex19Del EGFR突变，其中也包含其他EGFR突变（经典+罕见）；②在同一等位基因上同时发生的多个独特的罕见EGFR突变（罕见+罕见）；或③L858R和Ex19Del EGFR突变（经典+经典）的组合。据报道，复合突变占NSCLC中EGFR突变的约5%～15%［23，24］。

7.1 临床前研究

Kohsaka等［25］人在一组NSCLC标本上进行EGFR外显子测序，发现超过90%的G719X突变（n=15）以复合突变形式存在。COSMIC数据库（n=102）中超过75%的E709X突变也以复杂突变的形式存在。Kohsaka等在NIH-3T3和Ba/F3细胞 系 模型中，在顺式表达复杂突变的NIH-3T3细胞比单一突变或反式复合突变形成更多的病灶。表明复合突变的转化潜力要比单独的罕见EGFR突变的转化潜力更高。使用高通量筛选评估单个突变和复合突变的EGFR突变对吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和奥西替尼的反应的研究中，发现每个复杂EGFR突变的IC50值介于每个对应的单个EGFR突变之间。例如，吉非替尼单独治疗L858R（4.4 nM）的IC50值低于L858R+E709A（259 nM），但是与单一E709A罕见突变（785.8 nM）相比，复杂突变对药物治疗更敏感。有趣的是，不可逆的第二代EGFRi阿法替尼并未观察到这些差异，阿法替你在所有测试的单个和复杂EGFR突变中均相似的抑制作用。

表1

7.2 临床研究

复合突变的患者对EGFRi的反应差异性很大。罕见的EGFR突变与经典L858R或Ex19Del突变（罕见-经典组合）对EGFRi治疗敏感［26，27］。Baek等［27］报道，EGFRi治疗复合的经典和罕见突变组合（经典-罕见组合）的中位PFS为7.4个月，复合的罕见和罕见突变组合（罕见-罕见组合）的中位PFS为5.1个月次之，而单个的罕见突变的PFS最短中位PFS分别为1.3个月和2.6个月。这支持了临床前数据，复杂突变比单个罕见突变对EGFRi更敏感［25］。

8 罕见突变的免疫治疗

越来越多的证据支持在NSCLC中使用免疫疗法进行治疗，与约20%的晚期NSCLC患者（包括帕博利珠单抗，纳武利尤单抗）化疗相比，靶向PD1/PD-L1免疫检查点抑制剂已显示出明显的PFS和OS获益。与具有经典EGFR突变的NSCLC患者中相比，罕见的EGFR突变与更长的中位PFS相关［28］。

对接受帕博利珠单抗或纳武利尤单抗治疗的EGFR突变NSCLC患者的回顾性分析显示，与具有经典突变的患者相比，具有G719X和外显子20插入突变的患者具有更长的中位PFS（8.4个月vs.1.6个月）。但这项研究样本量较小（n=27），需要进行更大样本量的未来临床研究以验证罕见EGFR突变的免疫疗法的有效性。此外，免疫疗法是否优于现有的EGFRi（如阿法替尼）尚不明确。山田等［29］报道了用帕博利珠单抗或纳武利尤单抗治疗外显子20插入突变的患者的中位PFS为8.4个月，而接受阿法替尼治疗的外显子20插入的中位PFS 2.7个月。这些数据表明免疫疗法可能是外显子20插入突变的首选治疗选择。

另外一项研究［30］描述了4例具有罕见EGFR突变和高PD-L1表达（＞50%）的NSCLC患者。该研究中3名带有G719X突变，用帕博利珠单治疗有效。其余1例患者具有E746_T751delinsA+T790M复合突变，尽管PD-L1表达达60%，但对帕博利珠单抗治疗无反应。另一项Ⅰ期临床研究中，Getting等人［31］报告称13名EGFR突变患者中有2例患者在使用纳武利尤单抗5年随访中仍存活，这两个患者均携带罕见的突变（分别为G719A和外显子20插入突变）且PD-L1表达低（＜1%）。携带G719A的患者在治疗方案完成后16个月出现部分疾病进展。继续使用纳武利尤单抗又获得了再8个月的PFS。携带第20外显子插入突变的患者在接受纳武利尤单抗治疗后获得9个月的PFS。总的来说，这些研究表明免疫疗法可能对某些罕见的EGFR突变有效。

另一种潜在的策略是将EGFRi与免疫疗法相结合来获得更好的临床疗效。EGFRi和体外免疫疗法的结合已表明，短期厄洛替尼治疗可以通过上调caspase介导的凋亡来增强具有经典EGFR突变的NSCLC细胞系对细胞毒性杀伤细胞和T细胞杀伤的敏感性［32］，即序贯或联合的EGFRi和免疫疗法可能会延迟对靶向疗法的耐药性产生，增加反应性。正在进行一些临床试验，评估在未接受EGFRi治疗或对EGFRi耐药的NSCLC中EGFRi和免疫疗法的结合［33］。尽管这些试验的数据尚不成熟，但与单独的EGFRi相比，免疫疗法和EGFRi联合疗法可能使患者耐药时间延长［34］。因此，需要进一步的研究工作来阐明患者中EGFRi和免疫疗法之间是否存在协同作用，哪些患者最有可能受益，以及最佳药物调度策略将是什么。

9 总结

与经典EGFR突变相比，许多罕见的EGFR突变与对第一代EGFRi的反应较差，但是临床研究已经提示，二代或三代TKI，如阿法替尼等可能具有更好的临床疗效。免疫疗法在具有罕见EGFR突变的患者中初步显示出疗效效，可能为EGFRi罕见突变或反应性差的患者打开了新的治疗策略。研发更有效的预测免疫治疗疗效的标记物，以及免疫治疗联合化疗或靶向治疗的有效性，可能是未来的主要研究方向之一。