基于Box-Behnken响应面设计法结合熵权法优选脑络欣通方提取工艺

赵国栋，洪璐，王倪，何玲，张善堂，陈卫东*（.安徽中医药大学，合肥 300；.新安医学教育部重点实验室，合肥 30038；3.安徽省立医院，合肥 3000）

脑络欣通方（Naoluo Xintong decoction，NLXTD）是新安医学用于中风治疗的临床验方，由黄芪、川芎、三七等七味中药按照君臣佐使理论配伍而成。全方活血寓于补气之中，气贯经脉以助血行，营血流畅经脉得养，临床疗效显著。现代药理学研究表明脑络欣通方治疗缺血性中风疗效显著，在促进神经功能恢复，减小脑梗死体积，改善脑缺血再灌注损伤伴有的局部过度炎性反应等方面体现出显著的治疗优势[1-3]。长期以来，脑络欣通方应用于临床多以汤剂的形式，其疗效确切、易吸收、起效迅速[4]。但汤剂存在剂量不准确，药效不稳定，服用量大，携带和运输不便，不易保存等缺点，限制了其临床应用和发展，故需要改进剂型。

响应面法（RSM）是一种综合试验设计和数学建模，通过对具有代表性的局部各点进行试验，回归拟合全局范围内因素与结果间的函数关系，取得各因素最优水平值的优化方法；具有试验次数少、精密度高、模型预测性能好、可用于研究几种因素间交互作用等优点[5]。熵权法（EWM）则是经过对试验获得的数据进行整理，计算和分析，进而得出各项试验指标的权重系数[6]。采用两者结合的方式优化中药提取工艺，既可以系统地对影响中药提取工艺的各因素及因素间相互作用进行研究，又有利于降低人为主观因素造成的试验结果偏差，使试验结果更具有科学性和合理性。

基于此，为更好地进行脑络欣通方的新药开发工作，本研究依据中药新药研发的相关要求，结合生产实际，采用Box-Behnken 响应面设计法，选择脑络欣通方提取液中3 种成分（羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸）的含量及复方出膏率作为考察指标，运用熵权法对试验结果进行综合评价，旨在优选出脑络欣通方提取工艺的最佳工艺参数，为其剂型改进提供试验依据，并为该方进一步的研究与开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20ADXR 液相色谱仪（日本岛津仪器有限公司）；电子天平（型号：PA1004B，上海越平科学仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（型号：WB-2000，郑州长城科工贸有限公司）；数控超声波清洗器（型号：KQ2200，江苏省昆山市超声仪器有限公司）；CP2250 分析天平（精度：0.01 mg，奥豪斯国际贸易有限公司）。

1.2 试药

羟基红花黄色素A（批号：R25A9F 59977）、毛蕊异黄酮苷（批号：Y27F9H 54731）（对照品，质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；阿魏酸对照品（批号：110773-201614，质量分数≥98%，中国食品药品检验研究院）；液相用乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他化学试剂均为分析纯。黄芪（批号：200601）、红花（批号：200601）、三七（批号：200601）、川芎（批号：200601）、天麻（批号：200601）、当归（批号：200601）（安徽友信药业有限公司），蜈蚣（批号：160801，安徽亳州广印堂中药有限责任公司），均经安徽中医药大学俞年军教授鉴定其为正品。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备[7]

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称定羟基红花黄色素A 2.38 mg、毛蕊异黄酮苷1.00 mg、阿魏酸1.00 mg 对照品置于5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制成含羟基红花黄色素A 476.00 μg·mL－1、毛蕊异黄酮苷200.00 μg·mL－1、阿魏酸200.00 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 按照脑络欣通方药材比例称取药材40 g（黄芪∶川芎∶三七∶天麻∶当归∶红花∶蜈蚣＝15∶5∶3∶5∶5∶5∶2），精密称定，将除蜈蚣以外的其余药材全部置于圆底烧瓶中，精密加入8 倍量超纯水浸泡30 min，回流提取1 h，趁热用纱布过滤，得到药渣与煎出液，重复一次，合并提取液；将蜈蚣研磨成粉状物加入提取液中，将混匀的提取液低速离心（3000 r·min－1，10 min），取上清液经布氏漏斗抽滤得滤液，弃去滤渣，再用旋转蒸发仪浓缩至1 mL 含生药0.5 g；精密量取4 mL 浓缩液加入6 mL 无水乙醇，静置沉淀24 h，取上清液1 mL 用5%的乙腈稀释2 倍，过0.22 μm 滤膜，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按处方配比，分别称取除红花以外、除黄芪以外以及除川芎、当归以外的其他药材，按制备工艺制成复方水提液，再按“2.1.2”项下方法制得阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Unitary C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃；流速：0.8 mL·min－1；检测波长：230 nm；流动相：乙腈（A）-0.05%的磷酸水（B）；梯度洗脱程序：0～18 min，5%～17%A；18～28 min，17%～20%A；28～40 min，20%～25%A；40～45 min，25%～90%A；45～55 min，90%A；55～60 min，90%～5%A。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性及系统适应性考察 分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液20 μL，按“2.2”项下色谱条件进样分析，结果表明，羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷及阿魏酸均能与其他组分达到基线分离，各吸收峰的理论塔板数均不低于5000，且阴性样品溶液无干扰（见图1）。

图1 混合对照品（A）、供试品（B）、缺红花阴性样品（C）、缺黄芪阴性样品（D）及缺川芎、当归阴性样品（E）的HPLC 图Fig 1 HPLC of mixed reference substance（A），sample（B），negative sample without Carthami Flos（C），negative sample without Astragali Radix（D），and negative sample without ChuanXiong Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix（E）

2.3.2 线性关系考察 以“2.1.1”项下混合对照品溶液作为母液，进行倍比稀释，制成一系列质量浓度的混合对照品溶液。按照“2.2”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），相应的峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。羟基红花黄色素A：Y＝1.28×104X＋1.84×105，r＝0.9998；毛蕊异黄酮苷：Y＝3.84×104X－1.10×105，r＝0.9999； 阿魏酸Y＝3.79×104X－2.59×105，r＝0.9999；羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸在46.648～466.480 μg·mL－1、19.600～196.000 μg·mL－1、19.600～196.000 μg·mL－1与峰面积呈良好线性关系。

2.3.3 精密度考察 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，计算羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸峰面积RSD分别为0.67%、0.08%、0.06%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液6 份，分别放置0、2、4、6、8、12 h 进样。计算羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸峰面积RSD分别为1.2%、1.4%、2.0%，结果表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.3.5 重复性试验 选取同一批药材，按脑络欣通方药材比例称取药材40 g，精密称取6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，记录羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸的色谱峰面积，RSD值分别为1.5%、1.8%、1.9%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收试验 取已测定的同一批药材，按脑络欣通方中药材的比例精密称取药材40 g，共6 份，按“2.1.2”项下方法制备提取液，分别精密加入一定量的混合对照品溶液，制得供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样测定，羟基红花黄色素A 平均回收率为99.4%，RSD为1.3%；毛蕊异黄酮苷的平均回收率为100.1%，RSD为1.5%；阿魏酸的平均回收率为100.3%，RSD为1.3%，说明该方法回收率良好。

2.4 出膏率测定

精密量取供试品溶液40 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于真空干燥箱中烘干至恒重，取出，移置干燥器中，冷却，迅速称重，计算出膏率。

2.5 单因素试验

按照脑络欣通方药材比例称取药材40 g，加入10 倍量的超纯水，考察不同浸泡时间（20、30、40、50、60 min），提取时间（30、60、90、120 min），提取次数（1、2、3、4 次），对脑络欣通方中羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸的含量及浸膏得率的影响。结果表明：各项指标的高低受浸泡时间、提取时间及提取次数影响显著，直观分析确定浸泡时间最优值在40～60 min 内，最优提取时间在60～120 min 内，最优提取次数在2～4 次内，故选三因素三水平进行响应面优化设计。

2.6 Box-Behnken 响应面法优化提取工艺

2.6.1 Box-Behnken 响应面法试验设计及试验结果 选择水为提取溶剂，以提取时间（x1）、提取次数（x2）、浸泡时间（x3）为考察因素，羟基红花黄色素A 含量（y1）、毛蕊异黄酮苷含量（y2）、阿魏酸含量（y3）及出膏率（y4）为评价指标，采用Box-Behnken 响应面法优化提取工艺。试验设计及结果见表1。

表1 响应面试验设计方案及结果Tab 1 Response surface test design

2.6.2 信息熵法对数据的分析[8]信息熵是系统不确定性和无序程度的度量，除了度量数据包含的信息量，还可在多指标评价系统中用于确定各指标权重。该法是将每个评价指标作为一个随机变量，计算该指标的熵权系数，其取值变异程度越大，越无序，提供的信息量越多，该指标就越重要；反之该指标就越不重要。用熵权法确定权重的计算步骤如下：

① 指标归一化处理：设m个评价指标n个评价对象的原始数据矩阵为X＝（aij）mn，对其归一化后得到X’＝（xij）mn，对正向指标而言，按照以下公式进行归一化。

X’ij＝（aij－min j {aij}）/（max j {aij}－min j {aij}），X’ij表示第i次试验时第j个评价指标的取值，i＝1，2，3，…，m；j＝1，2，3，…，n。

② 将原始数据阵（aij）mn转换为概率矩阵（Pij）mn；在信息熵公式中Pi为某个信息的概率，满足0 ≤Pi≤1，因此必须先对矩阵（aij）mn进行归一化处理，经处理后的矩阵可视为评价指标的概率矩阵。其中Pij表示第j次试验在第i个评价指标下的概率。

③ 计算指标的熵值，确定第i个评价指标的信息熵（Hi）。

④ 计算指标的熵权系数（Wj）。

运用Design-Expert 10 软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合分析，得到提取时间（x1）、提取次数（x2）、浸泡时间（x3）与综合评分（Y）之间的二次多元回归模型方程：

表2 各指标熵值及权重系数Tab 2 Entropy value and weight coefficient of each index

Y＝0.33 － 0.061x1－ 0.061x2＋0.08x3＋0.12x1x2－ 0.17x1x3－ 0.19x2x3＋0.064x12＋0.089x22－3.750×10－3x32

对综合评分值模型进行方差分析，结果方程决定系数r2＝0.9502，表明该回归模型的拟合情况良好。由二次回归模型方差分析结果（见表3）可知，该模型具有高度显著性，可信度高，失拟项不显著，说明该模型拟合度较好，可以对不同条件下的目标指标进行预测。

表3 方差分析结果Tab 3 Variance analysis

2.6.3 响应面优化提取工艺 根据拟合的二次回归模型，采用Design-Expert 10 软件绘制综合评分值随因素变化的三维曲面图和等高线图，如图2所示。图2A 显示浸泡时间为50 min 的条件下，提取时间和提取次数对综合评分值的影响，提取时间的最优区域是60～120 min，提取次数的最优区域是2～4 次。图2B 显示提取时间为90 min的条件下，浸泡时间和提取次数对综合评分的影响，浸泡时间的最优区域是40～60 min，提取次数的最优区域是2～4 次。图2C 显示提取次数为3 次的条件下，浸泡时间和提取时间对综合评分值的影响，浸泡时间的最优区域是30～50 min，提取时间的最优区域是60～120 min。

图2 不同因素对综合评分值影响的等高线图与响应面图Fig 2 Contour map and response surface map of influence of different factors on the comprehensive scores

2.6.4 验证试验 结合二次回归方程，求解得到最佳工艺条件为提取74.53 min，浸泡59.94 min，提取2.20 次（综合评分预测值0.850）。考虑到实际工艺生产，求得的最佳工艺条件均取整数，即提取74 min，浸泡60 min，提取2 次。在该工艺下平行试验3 次，测定指标成分含量和出膏率。实测综合评分值分别是0.824、0.870、0.815，与预测值之间的RSD均小于3%，证明该工艺稳定可靠。

3 讨论

以往的复方提取工艺研究，较多是对料液比、提取时间及提取次数进行考察。在预试验中选择8 倍、10 倍、12 倍的料液比在其他因素相同的条件下分别提取。结果显示，3 组所得样品的指标成分含量及出膏率并没有体现出显著差异。考虑到脑络欣通方中有效成分大多为亲水性成分，如羟基红花黄色素A，相较于料液比，浸泡时间产生的影响往往更大。因此，本试验选择浸泡时间、提取时间及提取次数作为考察因素。

在考察指标的选择中，考虑到毛蕊异黄酮苷是黄芪改善缺血性脑卒中的重要活性成分[9-10]，具有促进血管新生，增加缺血再灌注大鼠脑细胞中膜的流动性等作用。阿魏酸为当归和川芎的指标成分[11]，具有抗血小板聚集、解除血管平滑肌痉挛、抗氧化和清除氧自由基、提高膜稳定性等药理作用[12]。羟基红花黄色素A 是红花中的主要活性成分，具有活血、化瘀、通脉的功效，能够有效治疗缺血性脑卒中[13]。此外，在高效液相色谱图中也能直观发现羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷及阿魏酸具有相对较高的峰面积，色谱峰易于辨识。浸膏作为中药药效的物质基础，出膏率的变化往往影响有效成分的含量变化，从而影响中药复方的药效。综上，本试验选取羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸3 个活性成分含量以及出膏率作为考察指标。

除考察指标的选择外，各项指标的权重系数同样影响着试验结果的可靠性。依据个人经验主观赋权往往会导致试验结果出现偏差，缺乏科学性与合理性。本试验基于熵权法计算各项指标的综合权重，结果更具有稳定性和可靠性，能够为脑络欣通方提取工艺研究提供参考。