长链非编码RNA SNHG1对肝细胞癌细胞侵袭和迁移能力的影响及其分子机制

张营慧，朱会芳，千新来

新乡医学院病理学系，河南新乡453000

肝细胞癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，其病 死率居恶性肿瘤的第二位［1］。近年来，尽管在HCC的防治方面已取得了一定程度的进展，但患者的长期生存情况仍然不佳［2］。肿瘤的侵袭和转移是HCC患者死亡的主要原因，而肿瘤的侵袭、转移与上皮间质转化（EMT）的关系非常密切［3］。分子靶向治疗是临床治疗肿瘤的新手段，在分子水平研究HCC的发病机制有助于寻找相应的靶标，提高HCC的临床治疗效果。长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们不编码蛋白质，而是以RNA的形式通过调控基因的表达在多种生理病理过程中发挥重要作用［4］。lncRNA异常在肿瘤生长、侵袭、迁移过程中发挥具有重要的调控功能，从而起到抑癌或促癌的作用［5-6］。SNHG1是新发现的lncRNA家族成员之一，在非小细胞肺癌［7］、垂体瘤［8］、骨肉瘤［9］和胰腺癌［10］等恶性肿瘤细胞的进展中发挥重要作用。研究显示，SNHG1高表达可促进非小细胞肺癌［7］、骨肉瘤细胞［9］以及垂体瘤细胞［8］的迁移。但是，目前关于SNHG1在HCC细胞侵袭和迁移中作用及机制的研究少见。2020年1月—2021年3月，我们采用siRNA技术干扰HCC细胞中SNHG1的表达，观察其对细胞侵袭和迁移能力的影响，并探讨其作用机制与EMT的关系，旨在为HCC的分子治疗提供新的靶标。

1 材料与方法

1.1 材料人正常肝细胞L02和人HCC细胞HepG2、SMMC7721，由本实验室自主保存。10%胎牛血清、DMEM高糖培养基、100 mg/mL青霉素以及链霉素均购自美国Gibco公司；Transwell小室购自Corning公司；TRIzol、逆转录试剂盒和SYBR Master Mix试剂盒均购自日本Takara公司；转染试剂Lipofectamine3000购自苏州宇恒生物科技有限公司；引物合成、SNHG1 siRNA及NC siRNA均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成；RIPA裂解液、BCA试剂购自南京凯基生物公司；α-Tublin单克隆抗体、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）抗体购自英国Abcam公司；SDS-PAGE、PVDF膜和ECL发光试剂盒购自美国Merk公司。

1.2 正常肝细胞和HCC细胞培养将L02、HepG2、SMMC7721细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到80%以上，进行传代。

1.3 正常肝细胞和HCC细胞中SNHG1表达检测采用qRT-PCR法。取对数生长期细胞，使用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，分光光度计测量RNA浓度及纯度，取1µg RNA，按照逆转录试剂盒说明书将其逆转录成cDNA。按照SYBR Master Mix试剂盒说明书，进行qPCR检测。引物序列：SNHG1上游5′-GGGG⁃TACCGTTCTCATTTTTCTACTGCTCGTG-3′，下游5′-CGGGATCCATGTAACAACATTTTATTATTTTCATC-3′，GAPDH上 游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下 游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 HCC细胞分组与转染取对数生长期的HepG2和SMMC7721细胞，接种于6孔板中进行培养。将两种细胞各分为两组，干扰组和对照组。使用Opti-MEM分别孵育siRNA干扰片段、NC片段及Lipofectamine3000，混匀后静置5 min。然后将Lipo⁃fectamine3000与Opti-MEM的混合液分别加入siRNA混悬液以及NC混悬液中，混匀后静置20 min。之后分别加入HepG2和SMMC7721细胞中，转染48 h后收集细胞。采用qRT-PCR法检测细胞中SNHG1表达，步骤同“1.3”。结果显示HepG2细胞干扰组和对照组SNHG1的相对表达量分别为1.036±0.021、0.254±0.033，SMMC7721细胞干扰组和对照组SNHG1的相对表达量分别为1.009±0.014、0.476±0.072。两种细胞干扰组SNHG1表达均较对照组降低（P均<0.05），表明干扰成功。

1.5 HCC细胞侵袭能力观察采用Transwell实验。取各组转染后的细胞，加入胰酶消化，制成单细胞悬液。在Transwell小室的的上室中接种200 µL含1×105个 细 胞；用500 µL含10%胎 牛 血 清 的DMEM完全培养基作为趋化因子置于下室，37℃、5%CO2培养箱内孵育24 h；加入4%多聚甲醛固定30 min，苏木素染色30 min，在正置光学显微镜下随机选取5个高倍视野进行计数、拍照，取其均值代表侵袭细胞数量。

1.6 HCC细胞迁移能力观察采用细胞划痕实验。取对数生长期细胞，胰酶消化并计数，将细胞按5×105/孔铺入6孔板内，37℃、5% CO2培养箱内孵育。待细胞生长至融合率达约90%时，用10 µL无菌枪头划板，轻摇并吸去原培养基，用PBS轻轻洗3次，去掉漂浮的细胞。倒置显微镜10倍视野下取点，分别记录划痕后0和24 h划痕宽度的变化，用Image J软件测量划痕宽度，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（24 h划痕宽度－0 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.7 HCC细胞中EMT相关蛋白E-cadherin、Vimen⁃tin检测采用Western blotting法。取对数生长期HCC细胞，加入RIPA裂解液，BCA法测定蛋白质浓度。每孔上样30 µg蛋白质，SDS-PAGE结束后，将蛋白质转移至PVDF膜，室温下5%脱脂牛奶封闭2 h。分别加入相应的一抗，4℃孵育过夜；HRP偶联的辣根过氧化物酶二抗孵育2 h，ECL化学发光。定影后用Image J软件分析条带光密度。以α-Tublin作为内参，计算目的蛋白与α-Tublin光密度比值，表示目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，HCC细胞与正常肝细胞中SNHG1表达的比较采用配对样本t检验，干扰SNHG1表达后细胞侵袭和迁移能力、EMT相关蛋白表达比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常肝细胞和HCC细胞SNHG1表达比较L02、HepG2、SMMC7721细胞SNHG1相对表达量分别为1.01±0.21、3.056±1.98、4.22±1.64，HepG2、SMMC7721细胞SNHG1表达均高于L02细胞（P均<0.05）。

2.2 干扰SNHG1表达对HCC细胞侵袭和迁移能力的影响与对照组比较，干扰组HepG2和SMMC7721细胞的穿膜细胞数、细胞迁移率均降低（P均<0.05）。见表1。

表1 HepG2和SMMC7721细胞转染后细胞侵袭和迁移能力的影响（±s）

表1 HepG2和SMMC7721细胞转染后细胞侵袭和迁移能力的影响（±s）

注：与对照组同类型细胞比较，*P<0.05。

组别干扰组HepG2 SMMC7721对照组HepG2 SMMC7721穿膜细胞数（个）99.26±15.12*142.75±20.66*286.57±45.22 309.15±68.37细胞迁移率（%）32.44±9.88*40.26±10.26*58.14±10.22 86.59±11.34

2.4 干扰SNHG1表达对HCC细胞EMT相关蛋白表达的影响与对照组比较，干扰组HepG2和SMMC7721细胞中Vimentin表达减少，而E-cadherin表达增加（P均<0.05）。见表2。

表2 HepG2和SMMC7721细胞转染后Vimentin、E-cadherin蛋白表达比较（±s）

表2 HepG2和SMMC7721细胞转染后Vimentin、E-cadherin蛋白表达比较（±s）

注：与对照组同类型细胞比较，*P<0.05。

组别干扰组HepG2 SMMC7721对照组HepG2 SMMC7721 E-cadherin蛋白6.255±0.698*3.624±0.858*2.642±0.061 1.052±0.027 Vimentin蛋白2.532±0.055*1.339±0.017*4.873±0.989 4.002±0.791

3 讨论

HCC是目前世界上病死率最高的恶性肿瘤之一，也是我国发病率和病死率位居前列的肿瘤之一。尽管在HCC的临床治疗方面做出了巨大的努力，但由于肿瘤的复发转移，HCC患者的总体生存率并没有提高。因此，研究其侵袭与迁移的分子机制，将为临床治疗HCC提供新的理论靶点。lncRNA是指长度超过200 nt、无或编码蛋白潜力有限的RNA转录本，它们可以在转录和转录后不同层次调控基因的表达水平。lncRNA可通过不同的分子调控机制参与HCC的发生发展。研究显示，lncRNA MALAT1通过上调剪接因子SRSF1，促进HCC的 恶 性 表 型 转 化［11］；lncRNA SNHG3通过miR-128/CD151级联激活诱导肝癌细胞EMT转化，并且SNHG3高表达与患者生存率降低以及化疗药物抵抗有关［12］。本研究结果显示，SNHG1在HCC细胞HepG2和SMMC7721中的表达均高于正常肝细胞，表明SNHG1与HCC的发生发展具有一定的相关性。

为了进一步探讨SNHG1在HCC中的作用及机制，本研究以HCC细胞系胞HepG2和SMMC7721为研究对象，通过干扰细胞中SNHG1表达，观察其对HCC细胞侵袭和迁移能力的影响。结果显示，干扰SNHG1表达后，HepG2和SMMC7721细胞的侵袭和迁移能力均显著下降，表明SNHG1能够促进HCC细胞的侵袭和迁移能力，证明其具有促癌作用。

EMT是指上皮细胞通过特定的生理或病理条件向间质细胞表型转变的过程，这一过程参与了组织胚胎发育及形成、器官分化及肿瘤浸润转移等重要的生理病理过程。在上皮肿瘤细胞EMT过程中，伴随有细胞骨架以及相关表型基因的改变。例如，上皮标志物E-cadherin的减少和间质标志物Vimentin的增加，使细胞紧密连接、极性丢失和间充质细胞形态转变，导致肿瘤细胞黏附作用减弱而运动能力增强，从而获得更强的侵袭和迁移能力［13-15］。本 研 究 结 果 显 示，干 扰 组HepG2和SMMC7721细胞间质标志物Vimentin表达减少，而上皮标志物E-cadherin表达增加。这表明lncRNA SNHG1可增强HCC细胞的侵袭及迁移能力，可能与其调控E-cadherin和Vimentin蛋白表达，从而促进EMT形成有关。然而，SNHG1如何调控EMT相关蛋白表达的具体机制尚不明确，有待进一步深入研究。

综上所述，lncRNA SNHG1在HCC细胞中呈高表达，并通过调控HCC细胞的EMT表型改变进而促进HCC细胞的侵袭与迁移能力，从而参与HCC的发生发展。本研究初步探明了lncRNA SNHG1在HCC侵袭与迁移中的功能及机制，为HCC的诊疗提供了新的靶标。