人参皂苷Rg1对高糖环境下人脐带血间充质干细胞分泌炎症因子水平的影响

梁文菲，张熙，彭阿建，欧阳范馨，朱晨鸿，谭梅鑫，兰宏伟，熊武

1湖南中医药大学中西医结合学院，长沙410208；2湖南省脑科医院湖南中医药大学临床医学院；3湖南中医药大学第一附属医院烧伤整形外科

间充质干细胞（MSCs）是一类具有多向分化潜能和自我更新能力干细胞，具有来源广泛、便于取材、免疫原性低等优点。近年来，MSCs因其具有调节免疫［1］、抑制炎症反应［2］等功能受到广泛关注。然而当MSCs所处内环境不同或机体功能发生变化时，其分泌功能将发生相应改变。而高糖环境可致MSCs数量、功能活性下降，增殖分化能力受损，并改变其分泌炎症因子的能力［3］。研究显示，某些中药或中药单体对MSCs增殖、凋亡、分泌炎症相关因子等功能可产生显著影响。人参皂苷Rg1是人参的主要有效成分之一，研究显示其能够促进人MSCs增殖，并具有抑制炎症反应的作用［4-5］。动物实验证实，人参皂苷干预骨髓间充质干细胞可显著降低糖尿病皮肤溃疡大鼠血清炎症因子水平［6］。关于人参皂苷Rg1能否通过调控高糖受损MSCs分泌炎症因子从而发挥调节炎症反应功能的机制尚未有相关研究。2020年4月—7月，我们观察了在高糖环境下人参皂苷Rg1对人脐带血间充质干细胞（hUCBMSCs）分泌炎症因子的影响，旨在进一步探讨人参皂苷Rg1调控炎症反应的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人脐带血来源无菌条件下取健康产妇剖宫产胎盘中的脐带血10 mL。本研究获得我院伦理委员会批准，产妇及家属均同意且签署知情同意书。

1.1.2 主要药品与试剂人参皂苷Rg1（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；青霉素—链霉素双抗溶液（南京凯基生物科技发展有限公司）；DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清、胰酶（美国GIBCO公司）；成骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基、成软骨诱导分化培养基（美国Cyagen公司）；茜素红染液、油红O溶液（美国Sigma公司）；阿利新蓝染液（中国MesGen公司）；白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器CO2细胞培养箱（日本SANYO公司）；荧光显微镜（北京同舟同德公司）；酶联免疫检测仪（美国Thermo Fisher公司）；生物倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2 hUCBMSCs的分离与培养将脐带血加入肝素抗凝，室温静置30～60 min。取1.077 g/mL淋巴细胞分离液5 mL加入15 mL离心管中，缓慢将10 mL脐带血与PBS液1∶1混合稀释的细胞悬液加入淋巴细胞分离液中。经密度梯度离心后，取单个核细胞移入含有5%胎牛血清、1%青霉素—链霉素双抗溶液的DMEM/F12培养基中，置于37℃培养箱中培养24 h后。更换培养液，连续培养7 d后将传代到第3代的细胞冻存。将冻存的第3代hUCBMSCs进行细胞复苏后，移入培养皿中，标志为第4代，置于37℃培养箱中继续培养。

1.3 hUCBMSCs的鉴定当第4代hUCBMSCs细胞融合到80%～90%时，加入胰酶消化，将细胞悬液接种到明胶包被的24孔板，每组设4个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞融合到60%～70%时，分别按照成骨诱导分化培养基、成软骨诱导分化培养基、成脂肪诱导分化培养基说明书要求，将细胞移入相应培养基中培养，每3 d更换一次培养基，观察细胞形态变化及生长情况，分别用茜素红、阿尔新蓝及油红O染液进行染色以确定细胞成骨、成软骨、成脂肪诱导分化效果，并将培养基置于荧光显微镜下观察并拍照。细胞成骨诱导分化后经茜素红染液染色细胞内可见红色结节沉积，成软骨诱导分化后经阿利新蓝染液染色可见细胞呈蓝色样改变，成脂诱导分化后经油红O染液染色可见细胞呈红色样改变，鉴定细胞为正常MSCs。

1.4 细胞分组与处理将鉴定成功的hUCBMSCs随机分为正常组、模型组、干预组。正常组加入DMEM/F12培养基培养5 d，模型组和干预组加入含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基培养5 d，建立高糖受损细胞模型。5 d后正常组和模型组再加入PBS培养48 h，干预组加入等体积质量浓度为40 mg/L的人参皂苷Rg1培养48 h。

1.5 细胞上清液中炎症因子水平检测收集三组细胞上清液，分别加入标准品稀释液、缓冲液、检测抗体稀释液，振荡，室温孵育后洗板，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，振荡，室温孵育后洗板，最后加入显色底物TMB和终止液，使用酶标仪测定上清液中IL-1、IL-6、IL-10、M-CSF、MCP-1在450 nm的OD值。

1.6 统计学方法采用SPSS24.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间均值比较采用ANOVA法，组间两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与正常组相比，模型组细胞上清液中IL-1、IL-6、MCP-1水平升高（P均<0.05）；与模型组相比，干预组细胞上清液中IL-1、IL-6水平降低，IL-10、MCSF水平升高（P均<0.05）。见表1。

表1 三组细胞上清液中炎症因子水平比较（±s）

表1 三组细胞上清液中炎症因子水平比较（±s）

注：与正常组相比，*P<0.05；与干预组相比，△P<0.05。

组别模型组干预组正常组IL-1 41.63±5.54*32.94±3.87△22.90±1.23 IL-6 113.29±6.91*45.43±5.41△28.12±6.79 IL-10 1.94±0.84 5.37±1.47△2.97±0.39 M-CSF 4.30±0.30 8.25±0.98△4.88±0.29 MCP-1 3 516.91±149.40*3 118.97±226.74 1 315.21±298.75

3 讨论

糖尿病是以长期慢性高血糖为特征的代谢障碍性疾病，高血糖可诱导、加重炎症反应。炎症反应是机体对于刺激的一种防御反应，通常情况下，炎症反应对机体有益，是一种以防御为主的天然局部反应，具有消除损伤因子、防止病菌扩散、促进受损组织愈合的作用；在某些情况下，炎症反应对机体有害，可作为某些疾病的病理生理基础，促进疾病的发生发展，如特应性皮炎［7］等。高糖环境与炎症反应密切相关，一方面高血糖可诱导、加重炎症反应；另一方面，慢性炎症反应可通过促进肝脏糖异生导致血糖生成过多，同时通过胰岛素抵抗来抑制机体对血糖的摄取，促进高血糖进一步发生。MSCs最早在骨髓中发现，是一类属于中胚层的多功能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，其中以骨髓组织中最为丰富。研究表明，MSCs具有调节免疫、抑制炎症反应、诱导移植耐受等功能［8］。以往研究认为，MSCs主要通过增殖、定向分化等途径发挥其治疗作用［9］；随着研究深入，人们发现MSCs还可通过调节炎症反应、改善炎症环境来实现其治疗作用［10］。MSCs极易被高浓度炎症相关因子吸引到组织损伤部位，其机制可能与MSCs受到炎症环境信号刺激时释放的抑制免疫反应分子促使其逃避免疫监视，并迁移到损伤部位有关［11］。另有研究显示，骨髓来源MSCs可通过其分泌的IL-6保护储存池中的中性粒细胞，使其免于凋亡［12］。以上研究表明，MSCs可通过调控炎症相关因子的释放发挥其调节炎症反应的作用。

人参皂苷Rg1是中药人参的主要有效成分之一，具有抗炎、调节免疫［13］、抗氧化应激［14］等作用。WU等［15］报道，负载人参皂苷Rb1/TGF-β1的丝素明胶多孔支架能够促进大鼠骨髓来源MSCs向软骨细胞分化，并抑制其炎症基因表达。马红伟等［6］报道，对糖尿病皮肤溃疡模型大鼠注入人参皂苷诱导分化骨髓间充质干细胞悬液可显著降低糖尿病皮肤溃疡大鼠血清炎症因子含量。本研究观察了在高糖环境下受人参皂苷Rg1干预hUCBMSCs分泌炎症相关因子IL-1、IL-6、IL-10、M-CSF、MCP-1的变化情况。IL-1是一种在炎症反应中发挥重要作用的因子，主要由活化的的巨噬细胞所产生。IL-1生物学功能广泛，可刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其免疫功能。此外，IL-1还具有促进其他炎症因子表达，诱导中性粒细胞浸润等功能［16］。IL-6是一种多功能细胞因子，在免疫反应、急性期反应及炎症反应中发挥重要作用，其表达增加常见于多种炎症性及肿瘤性疾病中［17］，常与IL-1共同参与炎症反应［18］，并与IL-1共同作为炎症指标之一。IL-10是一种免疫抑制因子，可通过抑制单核巨噬细胞释放炎症介质，促进抗炎因子释放来减轻炎症反应，其在体内最重要的来源是单核巨噬细胞和辅助T细胞［19］。M-CSF是一种具有谱系特异性的细胞因子，主要存在于骨髓腔内，其主要作用是促进单核细胞的分化与增殖，并维持单核巨噬细胞的活性。发生炎症反应时，由于炎症细胞的浸润，可激活机体产生大量M-CSF，同时M-CSF还可通过结合其受体引起单核巨噬细胞、内皮细胞释放更多M-CSF［20］。MCP-1是趋化因子C-C亚家族成员之一，具有趋化单核细胞、促进巨噬细胞浸润、上调促炎因子释放等功能［21］。

本研究结果显示，与正常组相比，模型组细胞上清液中IL-1、IL-6、MCP-1水平显著升高，表明高糖环境可诱导、加重炎症反应，而MCP-1分泌增加可能与高糖诱导炎症反应从而导致单核吞噬细胞系统细胞增生有关。经人参皂苷Rg1干预后，干预组细胞上清液中抑炎因子IL-10水平升高，促炎因子IL-1、IL-6水平降低，同时M-CSF水平增加。这表明人参皂苷Rg1具有抗炎作用，而M-CSF分泌的增加可能与人参皂苷Rg1能与相应受体结合发挥调节单核巨噬细胞系细胞分化与增殖，从而参与炎症反应有关［22］。这提示人参皂苷Rg1具有调控高糖诱导损伤hUCBMSCs分泌炎症相关因子从而发挥抑制炎症反应的作用。这一结果发展了人参皂苷Rg1具有调控炎症反应的理论基础，为后续研究人参皂苷Rg1调控炎症反应的机制奠定了基础。但是人参皂苷Rg1调控炎症反应的具体作用机制尚不清楚，有待后期研究进一步挖掘。