固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定海水中12种抗生素*

姜明宏，王金鹏，赵阳国,2**

(1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100；2.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100)

自20世纪30年代发现青霉素以来，抗菌药物被广泛应用于细菌感染类疾病的治疗。在水产养殖业和畜牧业中，抗生素作为饲料添加剂被广泛应用[1-2]。在许多国家，抗生素用于治疗和预防动物疾病来提高畜牧业生产力[3]。抗生素在生产生活过程中被释放到环境中，对生态系统造成各种不良影响[4]。在水环境中，抗生素的长期暴露会促进抗生素抗性细菌的繁殖，抑制水生有益微生物的生长[5]。据美国疾病预防控制中心估计，在美国每年至少有23 000人因体内病源菌对抗生素产生耐药性而导致死亡[6]。

抗生素种类繁多，残留基质复杂，使得抗生素难以定性定量检测。目前检测抗生素残留的分析方法有表面等离子体共振法[7]、荧光偏振免疫分析法[8]、化学发光酶免疫分析法[9]、液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法[10]等。基于多反应监测模式的高效液相色谱-质谱联用技术具有检测灵敏度高、线性动态范围宽、检出限低、特异性强等特点，在抗生素分析中得到广泛应用。例如，杜鹃等[11]使用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)对水中6类23种抗生素进行分析。结果显示，23种抗生素的加标回收率为47.3%～132.6%，方法检出限范围为0.1～2.9 ng/L；封孟娟等[12]使用电喷雾离子化正离子(ESI+)扫描MRM模式对5类40种抗生素进行分析，结果显示，40种抗生素的加标回收率为41.3%～112.6%，在1～200 μg/L水平下线性关系良好。

海水组成复杂，存在固相萃取目标物不完全、储存过程中目标物易流失等问题，同时在检测残留抗生素时，往往还出现基质干扰效应。为提高实验结果的准确性，添加回收率替代物13C3-咖啡因可以有效表征目标抗生素在整个实验过程中的回收率。Zhang等[13]在检测莱州湾海域抗生素浓度时，在固相萃取前添加13C3-咖啡因，用于表征在分析过程中目标抗生素可能产生的损失。

本研究采用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(SPE-HPLC-MS/MS)技术，建立了海水中3类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类)12种抗生素和一种回收率替代物13C3-咖啡因同步定性定量分析的方法，应用本方法对莱州湾海域21个海水点位进行抗生素检测。该方法可为莱州湾海域抗生素类污染物的环境生态风险提供参考依据，也为了解我国海水环境中抗生素的赋存水平提供数据。

1 材料与方案

1.1 仪器与试剂

HPLC-MS/MS系统：AB-Sciex Qtrap 4500质谱连接赛默飞Ultimate 3000液相色谱仪组成，联接接口为ESI源；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL，美国Waters公司)；24管防交叉污染SPE装置(美国Mediwax公司)；DC-12型氮吹仪(上海安谱公司)。

Milli Q超纯水(美国Millipore公司)；甲醇和乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸和甲酸铵(色谱纯，美国Sigma公司)。

12种抗生素标准品：盐酸四环素(TC，纯度≥99%)、盐酸金霉素(CTC，纯度≥99.9%)、土霉素(OTC，纯度≥98%)、强力霉素(DC，纯度≥98%)、磺胺嘧啶(SDZ，纯度≥99%)、磺胺甲恶唑(SMZ，纯度≥99%)、磺胺甲基嘧啶(SMR，纯度≥99%)和磺胺二甲基嘧啶(SM2，纯度≥99%)均购于阿拉丁公司(中国，上海)。诺氟沙星(NOR，纯度≥99%)、环丙沙星(CPFX，纯度≥99%)、依诺沙星(ENO，纯度≥99%)和恩诺沙星(ENRO，纯度≥99%)均购自于麦克林公司(中国，上海)。替代物13C3-咖啡因(13C3-caffeine，剑桥同位素实验室)。

分别称取一定量的抗生素标准品，用甲醇溶解并配制成100 mg/L的标准储备液，吸取回收率替代物13C3-咖啡因，用甲醇配制成1 mg/L的标准储备液，储存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 样品采集及前处理方法

在2019年5月，采集了莱州湾海域的21个采样点的水样。在水深3 m以内的海域所采集样品为表层水，即在0.2 m处采样。在水深为16 m海域所采集样品为表层水(0.2 m)、中层水(8 m)和底层水(15 m)。每个采样点用体积为1 L的棕色玻璃瓶采集水样3 L，在低温条件下保存并运回实验室，1周之内完成水样的前处理过程。

水样经0.45 μm混合纤维滤膜过滤，并量取1 L，加入回收率替代物13C3-咖啡因50 ng和0.2 g EDTA-Na。用盐酸将pH调至4，在Oasis HLB SPE小柱(200 mg/6 mL)上进行富集。上样前，依次用10 mL甲醇、10 mL超纯水和6 mL pH=4的盐酸水溶液对萃取小柱进行活化平衡；上样时，设置流速为5 mL/min；上样完成后先用10 mL超纯水淋洗萃取小柱，后用氮气对萃取小柱吹扫10 min，最后用甲醇-乙腈溶液(1∶1，v/v)进行洗脱。在30 ℃条件下，氮吹仪将洗脱液氮吹至近干，加入10%甲醇溶液并定容至1 mL。复溶后样品过0.22 μm水相滤膜，待测。

1.3 HPLC-MS/MS条件

1.3.1 HPLC条件 色谱柱：Waters Xterra MS C18(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)；进样体积：5 μL；柱温：30 ℃；流速：0.25 mL/min；流动相A：0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸铵溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～12 min，10%～60% 流动相B；12～16 min，60%流动相B；16～18 min，60%～10%流动相B；18～24 min，10%流动相B。

1.3.2 MS/MS条件 根据3类抗生素分子结构中的基团特征，同时参考文献[14-16]，采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，正离子模式，电喷雾电压(IS)5500 V，雾化温度(TEM)450 ℃，雾化气压力(GS1)379 kPa，辅助气压力(GS2)379 kPa，气帘气压力(CUR)275.8 kPa，入口电压(EP)15 V，碰撞室射出电压(CXP)2 V，干燥器雾化气均为液氮。

12种目标抗生素和1种回收率替代物13C3-咖啡因分别配成50 μg/L标准溶液，注入质谱仪，在ESI+条件下[M+H]+离子峰在质谱分析中被得到，通过优化碰撞能和去簇电压，分析二级信号并选择较强的2个母离子与子离子组成定量与定性离子对，进行MRM模式检测。测定12种抗生素和1种回收率替代物的质谱参数，测定结果见表1。

表1 目标物与替代物的MRM模式检测参数Table 1 MRM parameters of 12 compounds,and substitute

1.4 方法学评价

准确量取12种抗生素和13C3-咖啡因，配制成标准工作溶液(1 000 μg/L)。用甲醇对标准工作液进行稀释，获得浓度分别为1、5、10、20、50、100和200 μg/L的混合标准溶液，将混合标准溶液注入HPLC-MS/MS后建立定量离子峰面积(y)与质量浓度(x，μg/L)的线性关系。

将海水过0.45 μm滤膜，并进行121 ℃高温灭菌30 min，在处理过的海水中加入12种抗生素和13C3-咖啡因混合标准工作液，配制成5和50 ng/L的2个质量浓度水平的水样。对加标水样进行加标回收率的测定，并对未加抗生素的海水样品进行背景抗生素检测。水样固相萃取后进行HPLC-MS/MS测定，计算检出限、定量限和回收率(n=3)。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

在多重反应监测模式(MRM)下，优化碰撞能量(CE)，以使目标抗生素有最大峰面积(见图1)。结果表明：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、强力霉素、依诺沙星、恩诺沙星、环丙沙星最佳CE值为20 eV，磺胺二甲基嘧啶、土霉素、金霉素、四环素、诺氟沙星、13C3-咖啡因为25 eV，磺胺甲恶唑为15 eV。四环素类抗生素的CE值与Na等[17]所描述的相似，但部分磺胺类和喹诺酮类抗生素的CE值比本研究高5 eV。此外，通过优化去簇电压(DP)，以使检测目标抗生素的最大峰面积(见图1)。结果表明：磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、强力霉素、环丙沙星的DP值为20 V，磺胺甲恶唑、金霉素、四环素、依诺沙星、恩诺沙星、诺氟沙星为25 V，土霉素为30 V，13C3-咖啡因为15 V。

2.2 液相色谱条件优化

分别考察了Waters Xterra MS C18(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)色谱柱和Waters Symmetry C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)色谱柱对目标抗生素的分离效果和响应值，结果显示Waters Symmetry色谱柱对3种浓度为50 μg/L四环素类抗生素的响应值为5 500～12 000 cps，而Waters Xterra色谱柱对四环素类抗生素的响应值为19 000～55 000 cps，且分离效果更佳。

图1A 目标抗生素和13C3-caffeine最佳CE值Fig.1A The optimum collision energy of target antibiotics and 13C3-caffeine

图1B 目标抗生素和13C3-caffeine最佳DP值Fig.1B The optimum declustering potential of target antibiotics and 13 C3-caffeine

为使C18色谱柱填料中存在的硅醇基质子化，增强质谱信号响应强度、提高目标物在ESI+源的正离子化效率，同时降低其对含碱基基团的四环素类、喹诺酮类、磺胺类的吸附，减少峰形拖尾现象[18]，本实验选用酸性流动相且加入缓冲物质，保证流动相pH的稳定，故流动相A使用0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸铵溶液。调节梯度洗脱浓度，使13种目标物进行色谱分离(见图2)。图2表明，磺胺嘧啶、土霉素和环丙沙星三种抗生素的出峰时间较近，但总离子流图显示其各自的MRM峰形良好，这3种抗生素仍能较好分离。

(1.13C3-caffeine；2.SDZ；3.SMZ；4.SMR；5.SM2；6.NOR；7.ENO；8.CPFX；9.ENRO；10.DC；11.TC；12.OTC；13.CTC)图2 12种抗生素和13C3-咖啡因的HPLC-MS/MS总离子流图Fig.2 Total HPLC-MS/MS ion flow chart of 12 antibiotics and 13C3-caffeine

2.3 固相萃取条件的优化

2.3.1 上样流速 固相萃取是从水样中回收抗生素的关键步骤，也是最耗时的一步。了解抗生素在固相萃取柱上的吸附动力学，使抗生素以尽可能快的流速萃取是十分重要的。通过在不同流速(1～20 mL/min)下进行回收实验，对吸附动力学进行了研究。结果如图3所示，低流速(≤10 mL/min)有利于抗生素的萃取，平均回收率超过80%。当流速为10 mL/min以上，如15 mL/min时，目标物回收率明显下降。流速提高到20 mL/min时，回收率显著降低，如强力霉素的回收率仅为58%。Na等[17]和Tang等[19]分别采用了6和3 mL/min的低上样流速对抗生素进行固相萃取。因此，选择固相萃取的上样流速为5 mL/min。

图3 流速对12种抗生素和13C3-咖啡因吸附回收率的影响Fig.3 Effect of flow rate on adsorption recovery of 12 antibiotics and 13C3-caffeine

2.3.2 洗脱溶剂的种类 在固相萃取过程中，洗脱溶剂的种类是影响洗脱效率的重要因素之一，使用合适的洗脱溶剂能够使待测物的洗脱效率更高。实验选取甲醇、80%甲醇水(体积比为4∶1)和甲醇-乙腈(体积比为1∶1)等常用的溶剂作为洗脱溶剂，考察了其对12种抗生素和13C3-咖啡因洗脱效率的影响(见图4)。结果表明，80%甲醇溶液对目标抗生素的洗脱效果较差。甲醇-乙腈作为洗脱剂与甲醇相比，四环素类抗生素、磺胺类抗生素和喹诺酮类抗生素的平均回收率分别提高9.5%、3.83%和3.5%。采用甲醇-乙腈(体积比为1∶1)作为洗脱溶剂对12种抗生素和13C3-咖啡因的洗脱效率最大。崔敬鑫等[20]描述了分别以甲醇和乙腈作为洗脱剂对抗生素洗脱的影响。用甲醇进行洗脱，结果与本实验相类似。用乙腈进行洗脱，四环素类抗生素的回收率明显提高。因为对一些较弱极性的抗生素(四环素类)来说，乙腈具有良好的洗脱性能[21]。故选择甲醇-乙腈作为洗脱溶剂。

图4 不同洗脱溶剂对13种目标物回收率的影响Fig.4 Effect of different elution solvents on recovery of 13 target compounds

2.4 方法学评价

2.4.1 检出限、定量限与线性范围 结果表明，12种抗生素和13C3-咖啡因在1～100 μg/L的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数R2≥0.996，检测限(LODs，S/N=3)和定量限(LOQs，S/N=10)范围分别是0.07～1.78和0.24～5.93 ng/L(见表2)。

表2 13种目标物的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限Table 2 Linear equation,correlation coefficient,linear range,detection limit and quantitative limit of 13 targets

2.4.2 回收率和精密度 13种目标物的加标回收率为62.8%～106.6%，相对标准偏差(RSD)为1.1%～14.6%(见表3)，表明该方法具有较好的稳定性和重现性。

表3 13种目标物在海水样品中的回收率及相对标准偏差(n=3)Table 3 Recovery and relative standard deviation of 13 targets in seawater samples (n=3)

2.5 实际样品分析

2019年5月在莱州湾不同海域共采集21个点位的海水样品，样品中回收率替代物13C3-咖啡因的回收率为69%～104%。除CTC、TC和DC外，其余9种抗生素均被检出(见表4)，质量浓度在0.4～60.15 ng/L之间。从三类抗生素来看，磺胺类和喹诺酮类抗生素均有检出，且检出率较高，该结果与Zhang等[13]在莱州湾所采集的海水水样中检测到的磺胺类和喹诺酮类抗生素含量相当。在中国，依诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星在医疗中的使用较为频繁[22]，诺氟沙星和环丙沙星在家禽养殖和水产养殖中的应用也较为广泛。因此，这三种抗生素在莱州湾海域中的检出率较高，分别为73.3%、40%和46.7%。恩诺沙星仅用作兽药，其消费受到限制，与所调查的另三种喹诺酮类抗生素相比，检出率较低，为26.7%。四环素类仅检出土霉素，检出率为10%，含量为4.33～17.46 ng/L。

表4 莱州湾海域12种抗生素的暴露水平Table 4 Exposure levels of 12 antibiotics in Laizhou Bay

2.6 抗生素风险评估

抗生素类污染物对环境造成不良影响可以通过环境风险商(RQ)进行评估[23]。总体而言，莱州湾大部分海域的抗生素浓度对绿藻、水蚤和鱼类等相关敏感水生生物所存在的环境风险较低。在检出的9种抗生素中，磺胺甲恶唑对部分河口海域有低环境风险，诺氟沙星和恩诺沙星对所检出海域有低环境风险，依诺沙星对部分河口海域有中环境风险。Yan等[24]和Chen等[25]在中国长江口和黄埔江畔区域发现了类似的低等到中等的抗生素环境风险。

3 结语

本文建立了固相萃取-HPLC-MS/MS分析测定海水样品中的3大类12种抗生素的方法，分别对色谱及质谱条件、萃取时间和洗脱剂种类进行了优化。结果显示，12种抗生素的定量限范围为0.14～4.62 ng/L，加标回收率为62.8%～106.6%。用该方法对莱州湾海域21个海水样品进行检测，除四环素、强力霉素和金霉素外，其余9种抗生素均有不同程度的检出。本方法重现性好、结果可靠，可应用于海水样品中抗生素的测定。