Ni2+和金霉素共存对序批式反应器性能、微生物活性及其微生物群落的影响*

武原原,李姗姗,吴淑妍,潘云浩,于娜玲,赵长坤,高孟春**

(1.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100；2.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100)

Ni2+作为一种常见重金属离子，由于其独特的物理化学性质被广泛地应用于电镀、电池制造、催化剂和涂料等行业。Ni2+的需求量随着工业现代化的飞速发展迅速增长，对Ni2+的过度使用导致大量的Ni2+流入生活污水和工业废水，随后进入污水生物处理系统中[1]。微量的Ni2+有利于细菌的繁殖，但过量的Ni2+会对细菌生长、细胞内代谢和细胞外转化过程产生明显的抑制作用[2-3]。Ni2+具有较高的溶解性，可进入微生物细胞内影响微生物蛋白的结构和功能[4-5]。Ni2+能够影响活性污泥的结构进而影响生物脱氮效率[6-7]。抗生素在畜牧业中被广泛应用，用来预防和治疗动物疾病。金霉素(Chlortetracycline,CTC)是一种性能优良的广谱抗生素，因其效果好、成本低而经常被用作牲畜饲料添加剂[8-10]。CTC具有较高的水溶性，在使用过程中由于动物对其吸收能力有限，约30%～90%的CTC随着粪便和尿液被排放到水环境中[11]，并且已在不同水体中不同程度地检测到其残留，含CTC的废水不可避免地流入污水生物处理系统中[12]。CTC具有抗菌特性，能抑制微生物活性[13]，改变微生物群落结构[14-15]。CTC还能抑制细胞膜上甾醇的合成，从而影响细胞膜的通透性，使细菌屏障及运输物质功能受到阻碍。CTC可以进一步抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长[16]。由于污水生物处理系统中污水成分来源复杂，导致Ni2+和CTC的复合污染频繁发生。CTC作为一种强螯合剂，含有大量的电子供体官能团，可以与缺电子的Ni2+在水中会发生络合作用[17-18]。这种相互作用会改变Ni2+和CTC原有的毒性效应，因此研究Ni2+和CTC共存对污水生物处理系统的影响是有必要的。

近年来，Ni2+和CTC的生物毒性对生物反应器的影响已经引起了人们的广泛关注。Gikas等[2]发现浓度低于5 mg/L的Ni2+可刺激微生物的生长，并且可以增强生物反应器对污染物的去除能力。Khor等[19]研究了Ni2+对序批式反应器(SBR)性能的影响，发现Ni2+可以抑制SBR中化学需氧量(COD)和氮的去除。Di Capua等[20]发现Ni2+对自养反硝化反应器的性能表现出明显的抑制作用。Chen等[21]研究了CTC和抗生素抗性基因的动态变化，以及抗性基因和微生物群落之间的联系，发现CTC抗性基因的减少与微生物群落密切相关。Wen等[22]发现不同浓度的CTC能影响反应器内抗生素抗性基因和微生物群落的变化与演替，移动基因元件和微生物类群与抗生素抗性基因的增殖有显著的关系。然而，目前有关Ni2+和CTC共存对SBR性能、微生物酶活性、毒性和微生物群落的影响的研究却未有报道。因此，本文主要研究了Ni2+和CTC共存对SBR中COD和氮去除性能、活性污泥耗氧速率、脱氮速率、微生物酶活性和微生物群落的影响，并评价了Ni2+和CTC对活性污泥的生物毒性。

1 材料与方法

1.1 实验装置及运行条件

本研究采用尺寸和运行方式完全相同的4个有机玻璃管制成的SBR作为生物反应装置，将接种污泥(Seed sludge)加入4个SBR中，保证每个SBR中活性污泥的污泥浓度基本相同。其有效高度为50 cm，内径为14 cm，有效容积为7.7 L。进水通过蠕动泵进入SBR，处理后的出水通过反应器中间的电磁阀出口流出。SBR由时间继电器自动控制，每日运行4个周期，每个周期6 h，按缺氧好氧交替反应时间运行，具体运行参数如下：进水阶段5 min，缺氧阶段60 min，好氧阶段180 min，缺氧阶段60 min，沉淀阶段30 min，出水阶段5 min和闲置阶段20 min。在好氧阶段，空气通过曝气泵从反应器底部的砂芯微孔曝气头通入，并使用气体转子流量计调节曝气量，维持溶解氧在2 mg/L以上。磁力搅拌器在缺氧阶段运行，确保活性污泥和水充分混合，反应器中溶解氧浓度小于0.5 mg/L。SBR的容积交换率为50%，反应器定期排出一定量的污泥以使污泥龄保持在20 d左右。

1.2 接种污泥及水质

1.3 分析方法

2 结果与讨论

2.1 Ni2+和CTC共存对SBR性能的影响

图1 Ni2+和CTC共存对SBR性能的影响Fig.1 Combined effects of Ni2+ and CTC on the SBR performance

2.2 Ni2+和CTC共存对活性污泥比耗氧速率和脱氮速率的影响

图2表示长期暴露条件下Ni2+和CTC共存对活性污泥比耗氧速率(SOUR)和脱氮速率的影响。由图2(a)可知，在进水中未加入Ni2+和CTC时的第17天，4个SBR中活性污泥SOUR基本一致，此时各反应器活性污泥中微生物的代谢活性基本相同。17 d以后，分别向各反应器进水中持续添加相应浓度的Ni2+和CTC。在1～85 d的运行过程中，SBR0中SOUR仍维持稳定，表明实验期间对照组中SOUR基本保持稳定。在第85天，SBRNi、SBRCTC和SBRNi+CTC中SOUR均出现了降低，分别下降了15.34%、9.15%和16.49%，表明10 mg/L Ni2+单独存在及其与5 mg/L CTC共存能够抑制活性污泥中好氧微生物的代谢活性，这主要是由于重金属能够破坏细菌内的功能蛋白，从而影响其代谢。从图2(b)和图2(c)可以看出，在进水中未加入Ni2+和CTC时，4个SBR中SAOR和SNOR基本一致，此时活性污泥中氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的代谢活性基本相同。SBR0在1～85 d的运行过程中基本保持不变，而SBRNi、SBRCTC和SBRNi+CTC中SAOR在第85天分别下降了66.72%、8.05%和77.47%，SNOR分别下降了54.55%、7.43%和69.90%，表明长期暴露条件下，10 mg/L Ni2+单独存在及其与5 mg/L CTC共存均对氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的活性产生抑制作用，且二者共存呈现协同抑制作用。亚硝酸盐氧化菌(NOB)对Ni2+的耐受性优于氨氧化菌(AOB)。由图2(d)、(e)可知，进水Ni2+和CTC浓度为0 mg/L的SBR中活性污泥SNIRR和SNRR在1～85 d的运行过程中基本保持稳定，而SBRNi、SBRCTC和SBRNi+CTC中SNIRR和SNRR随运行时间的延长而逐渐降低。在第85天，SNIRR分别下降了54.11%、4.69%和65.25%，SNRR分别下降了59.02%、7.76%和66.37%。结果表明10 mg/L Ni2+单独存在及其与5 mg/L CTC共存均能抑制亚硝酸盐还原菌和硝酸盐还原菌的代谢活性，且二者共存呈现协同抑制作用。这主要是由于Ni2+破坏了某些微生物酶的组成和结构，降低了硝酸盐还原酶和亚硝酸盐氧化还原酶的丰度，从而影响到对氮的去除效果[26]。Yang等[27]发现土霉素和Cu2+共存对厌氧氨氧化系统存在拮抗抑制作用，且随土霉素比例的增加逐渐降低了Cu2+单独存在时对该系统的抑制作用。而Guo等[28]研究了Cu2+与红霉素共存对短程硝化的影响，发现Cu2+与红霉素对短程反硝化的影响呈现协同抑制作用，同时还发现协同抑制作用主要依赖于Cu2+的含量。这种区别可能是由于不同类型的抗生素和重金属离子作用而导致的。在本研究中，Ni2+和CTC也有相似的情况。Ni2+和CTC共存对脱氮速率呈现协同抑制作用。Ni2+和CTC对细菌的作用靶位不同，导致Ni2+与CTC的结合会产生更多的毒性。协同毒性主要依赖于Ni2+的含量，Ni2+对活性污泥中微生物的胁迫作用比CTC更明显。Ni2+与CTC共存对硝化和反硝化活性的抑制作用随着时间的增加而逐渐增大，且Ni2+和CTC共存对细菌的毒性也高于Ni2+和CTC单独存在时的毒性。

((a)SOUR；(b)SAOR；(c)SNOR；(d)SNIRR；(e)SNRR，“*”表示与未投加Ni2+ 和CTC 的对照组相比具有显著性差异(p<0.05)，误差线代表三次实验测量值的标准差。(a)SOUR,(b)SAOR,(c)SNOR,(d)SNIRR,and (e)SNRR.Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05)from the microbial activity at 0 mg/L Ni2+ and CTC.Error bars represent standard deviations of triplicate measurements.)图2 Ni2+和CTC共存对活性污泥比耗氧速率和脱氮速率的影响Fig.2 Combined effects of Ni2+ and CTC on SOUR and nitrogen removal rate

2.3 Ni2+和CTC共存对微生物酶活性的影响

由于微生物的硝化反硝化作用与相应的微生物酶活性密切相关，本研究探讨了Ni2+和CTC共存对微生物酶活性的影响(见图3)。DHA主要参与氧化磷酸化过程，在有机物生物降解过程中起关键作用。由图3(a)可知，在进水中未加入Ni2+和CTC时SBR0中DHA始终保持稳定，在1～85 d仅下降了6.48%。SBRNi、SBRCTC和SBRNi+CTC中DHA分别下降了20.57%、9.68%和19.44%。SBRNi中的DHA始终低于SBRCTC，表明10 mg/L Ni2+的毒性高于5 mg/L CTC。与Ni2+和CTC单独存在相比，可以推断出Ni2+对DHA的影响比CTC大，在二者共存条件下起主要作用。Yang等[29]发现在有机物降解过程中，DHA可以通过催化脱氢反应去除有机物中的氢原子。由于DHA能准确反应活性污泥中微生物的活性，DHA变化情况与SOUR相一致，表明Ni2+通过抑制DHA活性影响活性污泥的SOUR，从而影响有机物的去除。从图3(b)和图3(c)可以看出，在1～85 d，SBR0中AMO和NOR的活性均保持稳定。SBR0的AMO和NOR活动分别下降了2.52%和3.55%。SBRNi中的AMO和NOR分别下降了62.54%和58.06%。SBRCTC的AMO和NOR分别下降了6.41%和3.63%。AMO和NOR的变化表明10 mg/L Ni2+对NOR和AMO活性的抑制作用大于5 mg/L CTC。SBRNi+CTC中AMO和NOR的活性分别下降了71.25%和66.02%。与SBRNi和SBRCTC中AMO和NOR下降的活性相比，SBRNi+CTC中AMO和NOR活性始终更低，表明Ni2+和CTC共存对AMO和NOR的抑制率高于二者单独存在对AMO和NOR的抑制率，二者具有协同抑制作用。这与活性污泥SAOR和SNOR结果相一致，表明Ni2+和CTC共存抑制了氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的微生物酶活性，从而影响了氨氧化和亚硝酸盐氧化过程。由图3(d)和图3(e)可知，进水Ni2+和CTC浓度为0 mg/L的SBR中活性污泥的NIR和NR活性在1～85 d的运行过程中基本保持稳定，仅下降了2.79%和2.83%。SBRNi、SBRCTC和SBRNi+CTC中NR分别下降了46.02%、3.71%和58.40%，NIR分别下降了54.00%、5.87%和70.17%。以上结果表明，10 mg/L Ni2+对NIR和NR活性的抑制作用大于5 mg/L CTC。与SBRCTC和SBRNi中NIR和NR的活性下降相比，SBRNi+CTC中NIR和NR的活性始终更低，表明Ni2+和CTC共存对NIR和NR的抑制率高于二者单独存在对NIR和NR的抑制率，二者具有协同抑制作用。这与活性污泥SNIRR和SNRR结果相一致，表明Ni2+和CTC共存抑制了反硝化菌的微生物酶活性，从而抑制了硝酸盐还原和亚硝酸盐还原过程。

((a)DHA；(b)AMO；(c)NOR；(d)NIR；(e)NR，“*”表示与未投加Ni2+ 和CTC 的对照组相比具有显著性差异(p<0.05)，误差线代表三次实验测量值的标准差。(a)DHA,(b)AMO,(c)NOR,(d)NIR,and (e)NR.Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05)from the microbial activity at 0 mg/L Ni2+ and CTC.Error bars represent standard deviations of triplicate measurements.)图3 Ni2+和CTC共存对微生物酶活性的影响Fig.3 Combined effects of Ni2+ and CTC on microbial enzymatic activities

2.4 Ni2+和CTC对活性污泥的毒性评价

由于Ni2+和CTC对活性污泥的微生物酶活性有明显的抑制作用，因此评价Ni2+和CTC对活性污泥的生物毒性至关重要(见图4)。ROS的生成量被作为评估NPs生物毒性的重要指标，LDH的释放量被作为评估细胞膜完整性的标志。从图4(a)可以看出，SBR0和SBRCTC的活性污泥ROS生成量基本相同，SBR0和SBRCTC的ROS生成量分别增加了3.17%和7.72%，表明5 mg/L CTC对活性污泥没有明显的毒性作用。然而，SBRNi中活性污泥的ROS生成量显著增加，表明10 mg/L Ni2+可以促进微生物产生更多的ROS。与SBR0相比，SBRNi中活性污泥ROS的产生明显增加了55.81%。SBRNi+CTC中活性污泥ROS的生成量增加了66.23%，表明在长期暴露条件下10 mg/L Ni2+单独存在以及和5 mg/L CTC共存均能促进活性污泥产生ROS，二者共存对ROS的产生呈现协同促进作用。ROS的增加会打破氧化和抗氧化的动态平衡，从而引起生物体的细胞毒性[30]。由图4(b)可知，与SBR0比较，SBRCTC的LDH释放量无明显变化。在SBR0和SBRCTC中，活性污泥的LDH释放量仅增加了4.52%和7.72%。而SBRNi和SBRNi+CTC中分别增加了59.11%和75.42%，表明在长期暴露条件下10 mg/L Ni2+单独存在以及和5 mg/L CTC共存均能促进活性污泥产生LDH，二者共存对LDH的释放呈现协同促进作用，从而破坏了细胞膜的完整性，影响了活性污泥降解氨氮和有机物的性能。

((a)ROS production；(b)LDH release，“*”表示与未投加Ni2+ 和CTC 的对照组相比具有显著性差异(p<0.05)，误差线代表三次实验测量值的标准差。(a)ROS production,(b)LDH release.Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05)from the microbial activity at 0 mg/L Ni2+ and CTC.Error bars represent standard deviations of triplicate measurements.)图4 Ni2+和CTC共存对活性污泥ROS产生量和LDH释放量的影响Fig.4 Combined effects of Ni2+ and CTC on the ROS production and LDH release of activated sludge

2.5 Ni2+和CTC共存对微生物群落的影响

为了进一步研究Ni2+和CTC共存对活性污泥中微生物群落的影响，取进水中未加入Ni2+和CTC时的接种污泥Seed sludge(SS)和进水中加入Ni2+和CTC后运行至第85天的活性污泥样品(S0、SCTC、SNi和SNi+CTC)进行16S rDNA高通量测序，并将活性污泥样品的微生物群落结构进行对比分析，揭示Ni2+和CTC单独存在及二者共存对活性污泥中微生物群落的影响。表1为上述5种样品中微生物丰富度和多样性的指数变化情况。所有污泥样品的Good’s coverage指数均在0.998以上，表明所得到的序列库包含SBR中的大部分微生物物种，能够准确地反映微生物群落丰富度和多样性。SS、S0、SNi、SCTC和SNi+CTC的有效序列分别为791、834、330、490和377个操作分类单元(Operational taxonomic units,OTUs)。SS的Chao1、ACE、Simpson、Shannon指标分别为845.5、866.5、0.874、5.892。用Chao1和ACE指数能够反映微生物群落的丰富度，而Simpson和Shannon指数能够表征微生物群落的多样性。在进水中未加入Ni2+和CTC的情况下，S0的Chao1、ACE、Simpson和Shannon指数高于SS，而在添加Ni2+和CTC的情况下，这四个指数均出现了降低，表明Ni2+和CTC的存在显著降低了微生物的丰富度和多样性。在样品SNi、SCTC和SNi+CTC中，SNi+CTC的Chao1、ACE、Simpson和Shannon指数均低于SCTC，表明在Ni2+和CTC共存条件下，微生物群落的丰富度和多样性与CTC单独存在相比有所下降。此外，SNi+CTC中Chao 1和ACE指数均高于SNi中丰富度指数，而SNi+CTC中Simpson和Shannon指数均低于SNi中多样性指数，表明10 mg/L Ni2+和5 mg/L CTC共存对微生物的丰富度的抑制具有拮抗作用，对微生物的多样性的抑制具有协同作用。

表1 Ni2+和CTC共存对微生物丰富度和多样性的影响Table 1 Combined effects of Ni2+ and CTC on the microbial richness and diversity

采用主坐标分析(PCoA)，根据系统发育谱系分析上述5个污泥样品的整体变化规律(见图5)。污泥样品SS、S0、SCTC、SNi和SNi+CTC的分离较为明显。主坐标1 (PC1)和主坐标2 (PC2)分别占总菌群变化的40.84%和14.13%。SNi和SNi+CTC中的微生物群落聚集在一起。而SS、S0和SCTC中的微生物群落与SNi和SNi+CTC存在着明显的差异，表明5 mg/L CTC对微生物群落结构影响相对较小，而10 mg/L Ni2+以及Ni2+和CTC共存对微生物群落结构的影响较大。Venn图可以用来研究Ni2+和CTC共存对微生物群落相似性和差异性的影响(见图6)。SS、S0、SCTC、SNi和SNi+CTC中共有的OTUs为303，表明某些微生物可以在不同的条件下生存。在共有的OTUs中，优势菌门主要为Proteobacteria(46.53%)、Bacteroidetes(35.31%)、Chloroflexi(3.96%)、Planctomycetes(3.30%)、Acidobacteria(3.30%)、Verrucomicrobia(1.32%)和Cyanobacteria(1.32%)等。共有的OTUs在总OTUs(1 424)中的占比为21.28%。SS、S0、SNi、SCTC和SNi+CTC中特有的OTUs分别为204、131、2、23和45。特有的OTUs在总OTUs中的占比为28.44%，表明在每个反应器中都存在着相对较多特有的微生物。添加Ni2+和CTC的反应器中特有的OTUs数下降很多，表明Ni2+和CTC单独存在以及二者共存均可导致活性污泥中微生物群落发生明显变化。

图5 Ni2+和CTC共存条件下微生物群落的主坐标分析Fig.5 Principal co-ordinates analysis (PCoA)of microbial community in the presence of Ni2+ and CTC

图6 Ni2+和CTC共存条件下微生物群落的韦恩图Fig.6 Venn diagram of microbial community in the presence of Ni2+ and CTC

为了进一步探讨在添加10 mg/L Ni2 +和5 mg/L CTC后微生物群落的丰富度和多样性的变化，研究了微生物群落相对丰度在门水平和属水平的变化(见图7)。在门水平上(见图7(a))，5组活性污泥中为Cyanobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Planctomycetes、Verrucomicrobia 和Nitrospirae等菌门为主要组成部分，据已有报道指出，这些菌门是污水处理厂活性污泥中主要的微生物种群[31]。SS中，Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度最大，分别为35.51%和34.92%。与SS相比，SCTC中Bacteroidetes的相对丰度分别下降至24.93%，而Proteobacteria的相对丰度有所增加，增加到了70.89%。在SNi中也出现了相似的相对丰度变化结果，Bacteroidetes的相对丰度下降至28.31%，而Proteobacteria的相对丰度增加到了70.48%。然而，SNi+CTC中的相对丰度变化结果略有不同。与SS相比，SNi+CTC中Bacteroidetes的相对丰度下降至14.16%，而Proteobacteria的相对丰度升高到了47.06%。因此10 mg/L Ni2 +和5 mg/L CTC共存能对Proteobacteria相对丰度的升高产生拮抗抑制作用，对Bacteroidetes相对丰度的升高产生协同抑制作用。SNi和SNi+CTC中的其他菌门Chloroflexi、Acidobacteria、Planctomycetes和Actinobacteria的相对丰度与SS相比均降低，表明10 mg/L Ni2 +单独存在及其与5 mg/L CTC共存能抑制以上几种菌门的生长。Chloroflexi在硝化反硝化中起着至关重要的作用[32]，这可能是SNi和SNi+CTC脱氮性能变差的原因。在属水平上(见图7(b))，选择了35个属进行研究。Nitrosomonas在SS中的相对丰度为0.44%，在S0中相对丰度上升到了0.77%，然后在SNi+CTC中下降到了0.03%。Nitrosomonas是一种常见的氨氧化菌属，能够在有氧条件下将氨态氮氧化为亚硝态氮[33]。Nitrospira在SS中的相对丰度为0.15%，在S0中相对丰度上升到了0.87%，然后在SNi+CTC中下降到了0.02%。Nitrospira是主要的亚硝酸盐氧化菌属，能够在有氧条件下将亚硝态氮氧化为硝态氮[34]。Ni2+和CTC共存明显抑制了Nitrosomonas和Nitrospira的生长和繁殖，从而影响硝化过程。在添加Ni2+和CTC以后，反硝化菌属Zoogloea、Comamonas、Dechloromonas和Flavobacterium的相对丰度出现了升高，表面上述菌属对Ni2+和CTC具有较强的抵抗能力，而反硝化菌属Thauera、Longilinea、Denitratisoma和Anaerolinea的相对丰度出现了降低，这些菌属均能降低亚硝酸盐和硝酸盐[35-39]。上述结果表明，Ni2+和CTC对硝化菌属和反硝化菌属的生长及繁殖产生了影响，导致与硝化及反硝化过程有关的微生物群落的相对丰度发生变化，进而影响了SBR的脱氮效果。CandidatusAccumulibacter和CandidatusCompetibacter可以在缺氧阶段利用储存的糖原实现碳吸收以合成聚羟基脂肪酸，然后在好氧阶段利用聚羟基脂肪酸促进细胞增长并合成糖原[40]。在SNi+CTC中，CandidatusAccumulibacter和CandidatusCompetibacter的相对丰度分别从S0样本的3.82%和3.14%下降到了0.04%和0.05%，表明Ni2+和CTC共存可以抑制缺氧阶段微生物的碳吸收，进而抑制糖原的合成。此外，Lu等[41]指出CandidatusAccumulibacter还与生物除磷有关。由于对Ni2+和CTC毒性的敏感，某些菌属的相对丰度随着10 mg/L Ni2+和5 mg/L CTC的添加而降低，如Haliscomenenobacter、Fluviicola、Nannocystis和Ohtaekwangia等。相反地，某些菌属的相对丰度随着Ni2+和CTC的添加出现了明显的升高，如Bosea、Streptophyta、Flavihumibacter和Heliimonas等，表明这些菌属对Ni2+和CTC的毒性有着较强的耐受性。以上结果表明，长期运行条件下10 mg/L Ni2+和5 mg/L CTC共存能使活性污泥微生物群落结构和组成发生了较为明显的变化。

((a)门水平；(b)属水平。(a)Phyla level,(b)Genus level.)图7 Ni2+和CTC共存条件下微生物群落在门和属水平上的分类Fig.7 Microbial community of activated sludge at phyla and genus levels in the presence of Ni2+ and CTC

3 结语