中性粒细胞胞外诱捕网与牙周炎高凝状态的相关性研究

刘 欢,于 洋,王 哲，祝 率，付 蔷，胡腾龙1,

慢性牙周炎(CP)是牙周组织的慢性进行性炎症,长期的炎症环境导致牙齿周围支持组织的丧失,最终牙齿脱落,咀嚼功能紊乱,严重影响患者的生活质量[1]。作为口腔最常见的疾病之一,牙周炎影响了约46%的成年人[2]，在国内的发病率高达80%[3]。研究表明,牙周炎不仅是局部的病变,还与多种系统性疾病的发生有关，是心血管疾病发生的危险因素之一[4-5]。

在牙周炎患者病变局部存在大量的细菌,中性粒细胞作为机体的第一道防线,首先到达感染部位,发挥防御作用,在感染的牙龈上皮以及龈沟液中存在大量的中性粒细胞。2004年Brinkmann等[6]首次发现,中性粒细胞受到刺激可产生类似网状的结构——中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs),主要发挥捕获细菌的防御功能。随着对NETs研究的深入,发现NETs本身的网状结构和其上附着的多种酶导致凝血紊乱,在多种疾病的血栓形成中发挥作用[7-9]。因此,本研究以牙周炎患者的中性粒细胞为研究对象,观察其释放的NETs对重度牙周炎患者凝血指标的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年12月—2019年12月,于哈尔滨医科大学附属口腔医院牙周科就诊的20例重度牙周炎患者作为重度牙周炎组,以20例牙周健康者作为正常对照组。本研究经过哈尔滨医科大学伦理委员会审核批准,所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

选取标准:重度牙周炎:至少有一个牙齿邻间部位的牙周探诊深度(probing depth, PD)≥5 mm,至少有两个不在同一牙齿的邻间部位的临床附着丧失(clinical attachment loss, CAL)≥6 mm。正常对照组选取标准:PD≤3 mm,牙龈无炎症，无牙槽骨吸收。所有患者至少保留18颗牙齿,并且第三磨牙和需要拔除的牙齿不计算在内[10]。排除标准:心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、免疫性疾病等系统性疾病；吸烟；怀孕或者正在哺乳期的妇女；半年内接受过牙周治疗；6个月内有外伤或拔牙史者；3个月内使用过抗生素、类固醇或非甾体类抗炎药。

1.2 牙周检查

对所有研究对象进行牙周检查,每颗牙都检查6个位点:颊侧(近中、中、远中),舌侧(近中、中、远中)。用Williams牙周探针,检测牙龈指数(gingival index, GI)、PD和CAL水平。为了保证每一位患者检测的临床指标的可靠性,本实验由一位专业的牙周科医生对所有研究对象进行牙周检查,并记录相关指数。

1.3 血样采集

所有参与对象上午8:00—10:00采集空腹肘静脉血于两管枸橼酸钠抗凝管中,每管5 mL。一份送至本院检验科进行凝血指标检测,包括凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、D-二聚体(D-dimer)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fbg)；另一份用于中性粒细胞的制备和检测外周血中的NETs标志物髓过氧化物酶-DNA(myeloperoxidase-deoxyribonucleic acid, MPO-DNA)和胞外DNA(cell-free DNA, cf-DNA)。所有参与对象均是在牙周治疗前完成血样采集。

1.4 制备中性粒细胞

血液采集后,在30 min内,利用一步离心法获得中性粒细胞。利用Polymorphprep中性粒细胞分离液,450×g离心40 min,提取中性粒细胞。将细胞重悬在RPMI 1640中,500×g离心5 min,最后将细胞重悬于含有3%胎牛血清的RPMI 1640中,细胞的最终密度为1×106个/mL。用台盼蓝和流式细胞仪评估中性粒细胞，生存力>99%,纯度>94%[9]。

1.5 ELISA检测

cf-DNA和MPO-DNA代表NETs的水平。用Quant-iT-PicoGreen-dsDNA检测试剂盒(Invitrogen)检测牙周炎患者血浆中cf-DNA的水平,根据说明书进行操作。采用ELISA捕获法测定血浆中MPO-DNA复合物的含量。

1.6 免疫荧光

将中性粒细胞(1×106个/mL)接种到赖氨酸包被的24孔板上,在含5% CO2的室温环境下,用50 nmol/L的十四烷酸佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激3 h后,用4%多聚甲醛固定中性粒细胞,2%牛血清白蛋白(BSA)封闭,加入小鼠抗人的弹性蛋白酶、髓过氧化物酶抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜。第2天吸走一抗,PBS洗3次,加入兔抗鼠的弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)抗体和髓过氧化物酶(MPO)抗体(1∶100),室温下敷育0.5～1.0 h,PBS洗3次,每孔加入100 μL的DAPI,通透5 min,再用PBS洗1～2次,每次5 min。抠片,防淬灭的甘油滴在载玻片上,将细胞面朝下,扣在载玻片上,用指甲油封片。在荧光显微镜下观察NETs结构[9]。通过双盲实验统计每100个细胞所释放的NETs比例，每次结果均由两人观察得出，并且每项测试进行3次[11]。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。牙周炎组与正常对照组的GI、PD、CAL、PT、APTT、D-dimer、Fbg等指标的组间比较采用独立样本t检验。采用Spearman相关性分析对MPO-DNA、cf-DNA与PD、CAL、Fbg、D-dimer的相关性进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料

我们选取20例无系统性疾病的重度牙周炎患者,包括11例男性,9例女性,平均年龄为(56.73±6.81)岁。寻找年龄和性别匹配的对照组,包括11例男性,9例女性,平均年龄为(53.52±9.24)岁。性别和年龄不存在统计学差异(P>0.05)。

对研究对象进行牙周检查发现(表1),重度牙周炎组的GI较对照组明显增加(P<0.05)。重度牙周炎组的牙周指标PD显著高于对照组,两者之间的差异具有统计学意义(P<0.001)。通过对比CAL更显示重度牙周炎组牙槽骨吸收非常严重(P<0.001)。

表1 重度牙周炎与对照组牙周指标的对比

2.2 重度牙周炎组外周血中NETs标志物明显升高

我们通过检测cf-DNA和MPO-DNA间接反映NETs水平。通过ELISA实验测定两组外周血中的cf-DNA和MPO-DNA,结果发现,重度牙周炎组的cf-DNA水平显著高于对照组(P<0.01)，重度牙周炎组的MPO-DNA比对照组显著升高(P<0.05)，具体见表2。

表2 重度牙周炎与对照组外周血中NETs标志物对比

2.3 重度牙周炎组的中性粒细胞更易释放NETs

在免疫荧光显微镜下,可见重度牙周炎组外周血的中性粒细胞经过刺激后释放大量的NETs(图1),应用免疫荧光显微镜观察中性粒细胞周围存在大量的丝网状结构,进一步确认NETs结构。对照组中只存在少量的NETs,说明不同来源的中性粒细胞的活性存在差异,重度牙周炎患者的中性粒细胞处于明显活跃状态。

图A、B是应用50 nmol/L的PMA刺激中性粒细胞3 h后，通过染色在免疫荧光显微镜下观察NETs结构；A：对照组的中性粒细胞受到刺激后，未见明显的NETs结构；B：重度牙周炎组的中性粒细胞受到刺激后，可见明显的NETs结构(如图中白色箭头所指)；C：PMA刺激不同来源的中性粒细胞，然后测定NETs释放的百分比；D：以100个中性粒细胞为单位，观察中性粒细胞释放NETs的比值；蓝色：DNA；绿色：弹性蛋白酶；红色：髓过氧化物酶；**：与对照组相比P<0.01；图中标尺=20 μm；PMA：十四烷酸佛波醇酯

2.4 重度牙周炎组的凝血指标改变

通过检测凝血指标发现(表3),重度牙周炎组的PT与对照组相比缩短(P<0.05)；APTT在重度牙

表3 重度牙周炎组凝血异常

周炎组较对照组略有缩短,但无统计学意义(P>0.05)；重度牙周炎组的Fbg水平(P<0.01)、纤维降解产物D-dimer水平(P<0.05)较对照组明显升高。

2.5 凝血指标与NETs指标之间存在正相关关系

通过将cf-DNA和MPO-DNA与凝血指标进行相关性分析可见,NETs指标与凝血指标之间存在明显的正相关关系。见图2。

A、B：将对照组和重度牙周炎组的cf-DNA和D-dimer、Fbg进行相关性分析，随着cf-DNA水平的升高，D-dimer和Fbg水平呈明显上升水平；C、D：将对照组和重度牙周炎组的MPO-DNA和D-dimer、Fbg进行相关性分析，可见随着MPO-DNA水平的升高，D-dimer和Fbg水平呈明显上升水平；D-dimer：D-二聚体；Fbg：纤维蛋白原；cf-DNA：胞外DNA；MPO-DNA：髓过氧化物酶-DNA过Toll样受体，激活血小板，促进血小板活化，表达P-选择素，释放血小板活化因子-4，促进高凝状态的形成[18]。

3 讨 论

我们的研究发现,在重度牙周炎患者中,外周血中的NETs水平明显升高,并且中性粒细胞处于活跃状态,受到刺激后更易于释放NETs。此外,我们通过对凝血指标的检测发现,在重度牙周炎组明显存在异常的高凝状态,并且与NETs呈正相关关系。本研究首次验证NETs水平与重度牙周炎患者高凝状态的形成关系密切,这可能是其介导牙周炎与心血管疾病相互关联的机制之一。

牙周炎与冠心病、心肌梗死、动脉粥样硬化等心血管疾病关系密切[12-13],但是缺乏直接的证据证实。早期研究发现,牙周炎患者的凝血指标异常。PAI-1、vWF的水平随牙周炎严重程度的增加而增加,机体的纤溶能力下降[14],间接证实牙周炎患者处于高凝状态。

目前认为牙周炎与心血管疾病相关有多种机制。第一,由于细菌的长期存在,刺激机体持续的免疫反应, 免疫细胞募集到病变部位, 与细菌相互作用,释放趋化因子和促炎因子(如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等)，形成慢性炎症环境。炎症因子的增加,不仅加重组织损伤,还诱发全身性疾病[15-16]。第二，在免疫细胞迁移出血管的同时，会造成内皮损伤，破坏内皮细胞连接,增加血管的通透性，损伤的内皮细胞表达粘附分子促进中性粒细胞和血小板的募集，促进血栓形成[17]。第三,牙周致病菌可以通与健康人相比，牙周炎患者的中性粒细胞由于细菌的持续刺激，数目和反应活性均增加,并且寿命延长[19]。牙周致病菌侵入循环后，刺激中性粒细胞产生NETs。NETs的网状结构不仅可以捕获细菌，限制细菌的扩散,还可以捕获各种血细胞[20]。NETs的DNA骨架上附着多种颗粒酶，如弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶、瓜氨酸化的组蛋白等，这些颗粒酶激活凝血级联反应，促进凝血酶的生成[7,21]。

IL-6、IL-8可以促进NETs的释放,增加机体的凝血活性。通过中和炎症因子或者抑制炎症因子的生成,会降低NETs的产生[22]。当水解NETs结构,或者抑制NETs产生时,发现机体的促凝活性明显下降[22]。说明在慢性炎症性疾病中NETs在激活凝血级联反应中发挥重要作用。因此,在牙周炎患者中,随着疾病严重程度的增加,炎症因子水平升高,诱发机体活跃的中性粒细胞释放NETs增多,促进高凝状态的形成[8-9]。

Moonen等通过对比牙周炎患者和健康人的中性粒细胞在受到相同刺激下释放NETs的能力,结果并未发现显著的差异[23]。但是,此项研究的牙周炎对象选取的是中重度患者,而我们的牙周炎患者均选自重度牙周炎患者,这可能是造成差异的主要原因之一。另外，患者的个体差异以及牙周炎是否处于活动期都会影响实验结果。

研究显示，通过牙周治疗可以显著改善内皮功能障碍[24-25]，降低系统的炎症反应[26]。此外,牙周治疗后可以提高NETs的降解率,在牙周治疗3个月后,NETs的降解率提高10%[23]。由此可见,循环中的NETs在牙周治疗前也可能是内皮细胞损伤的原因之一。

我们的研究排除了基础疾病、性别和年龄对凝血系统的影响,但没有细致区分牙周炎患者是处于静止期还是活动期，并且样本量较少,只研究了重度牙周炎患者,未纳入牙龈炎、轻度牙周炎和中度牙周炎患者,也没有研究NETs如何促进牙周炎高凝状态形成的细胞分子机制。因此本研究的结论需要更大样本量和细致的分组研究进一步证实。

本研究通过对重度牙周炎患者和健康对照组循环中NETs水平、凝血指标的分析,在排除其他基础性疾病、性别和年龄差异的影响下,我们研究结果认为NETs影响重度牙周炎患者的促凝活性，并促进重度牙周炎高凝状态的形成。通过研究NETs对牙周炎凝血系统的影响,为牙周炎诱发心血管疾病的发生提供新的理论机制，抑制NETs的产生或者水解NETs结构可能有助于降低牙周炎诱发心血管疾病发生的风险。