纯钛表面负载聚多巴胺-黄芩苷复合涂层的制备及生物学评价

陈宇航，蔡佳诚，曹志龙，林鹭君，李伶俐，杨 凯，李 潇

自Brånmark首次提出“骨结合”理论以来，口腔种植学发展迅速[1]。骨种植体表面处理是影响骨结合的重要因素[2-3]，开发不同设计和表面的钛基种植体一直是研究的热点[4]。聚多巴胺是一种多功能的表面改性高分子，具有类似于多巴胺(DOPA，dopamine)的结构，因此可在任何材料表面(包括超疏水表面)进行粘附，具有惊人的粘合性能和机械性能[5]。有研究发现，传统中药成分可以同时具有抗菌和促成骨分化能力。黄芩苷是从植物黄芩的干燥根中提取分离出来的中草药成分，具有多种药理作用，如抗菌[6]、消炎[7]，并可促进成骨细胞分化[8]，推测其可应用于制备种植体表面涂层。本研究拟通过共沉积法制备富含聚多巴胺-黄芩苷的复合涂层，并探索其对骨髓间充质细胞的生物活性影响，可为构建具有生物活性的种植体涂层提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

实验材料：纯钛片(宝鸡鹏润新)；黄芩苷(纯度95%，上海麦克林)；盐酸多巴胺(纯度98%，上海麦克林)；CCK-8试剂盒(同仁，日本)；ALP试剂盒(中晖赫彩)；曲拉通X-100(上海麦克林)；DAPI染色试剂(10 μg/mL, Biosharp)；Calcein AM细胞活力检测试剂盒(美仑)。

实验细胞：SD大鼠骨髓间充质干细胞(中国科学院细胞库)。

主要仪器：Merlin 高分辨场发射扫描电子显微镜(Zeiss，德国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；电子万能材料试验机(Instron，美国)；接触角测试仪(Powereach，上海中晨)；EscaLab Xi+ X射线光电子能谱仪(赛默飞，英国)。

1.2 纯钛片预处理

商业圆形纯钛片(直径10 mm，厚0.3 mm)依次经800#、1 000#、1 200#鹰派砂纸打磨，然后用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗，每次15 min，取出后空气中干燥备用。

1.3 聚多巴胺-黄芩苷涂层的负载与实验分组

配制黄芩苷溶液及多巴胺溶液：分别称取一定量的黄芩苷粉末和盐酸多巴胺粉末溶于Tris-buffer缓冲液中，使黄芩苷溶液、多巴胺溶液浓度为2 mg/mL，并使用NaOH、HCl调节pH值至8.5。

将钛片分为4组，标记为纯钛(Ti)组、黄芩苷(B)组、聚多巴胺(PDA)组、聚多巴胺-黄芩苷(B-PDA)组。将B组钛片浸泡于足量黄芩苷溶液，PDA组钛片浸泡于足量多巴胺溶液，B-PDA组钛片浸泡于比例为1∶1的黄芩苷溶液、多巴胺溶液的混合液。避光保存24 h。

负载后处理：24 h浸泡后吸弃负载溶液，去离子水超声震荡仪中清洗15 min后，用PBS缓冲液清洗2～3遍。晾干后备用。

1.4 实验钛片的表征测试

1.4.1 场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察试件表面形貌 各组分别取2个钛片样本，经喷金处理后进行FESEM扫描。

1.4.2 表面接触角实验测试试件表面的亲水性 通过表面接触角测试仪动态检测去离子水滴在各组钛合金支架表面的接触角大小，每组3个样本，每样本选择2个不同位置，采集液滴影像并计算接触角。

1.4.3 钛片表面元素分析 通过X射线光电子能谱仪对样品表面的元素组成进行分析，每组3个样本，采用Al Kα射线为激发源。

1.5 生物学评价

1.5.1 细胞粘附实验 (1)将实验所需试剂、加样枪及枪头放入超净工作台，紫外灯消毒30 min；(2)将处理好的钛片分为4组：经抛光后的纯钛片(Ti组)、黄芩苷组(B组)、聚多巴胺组(PDA组)、聚多巴胺-黄芩苷组(B-PDA组)，于121 ℃高温高压灭菌后置于24孔板中，每组设置5个平行孔；(3)光镜下观察细胞，取对数生长期的BMSCs，在超净工作台上，弃去细胞培养瓶的原培养基，加入2 mL PBS磷酸缓冲液冲洗2～3次，加入1 mL胰蛋白酶消化细胞1～2 min；(4)将培养瓶置于光镜下观察细胞形态，轻轻震荡，待细胞变圆、间隙变大且悬浮时马上加入1 mL α-MEM培养基终止消化，多次轻柔吹打细胞，转移至15 mL离心管内，离心机1 000 r/min离心5 min；(5)弃去上清液后加入一定量的α-MEM培养基，将离心管内的细胞轻轻吹打成单细胞悬液，进行细胞计数；(6)以1×105个/孔的密度将细胞铺板，铺板后应注意将孔板摇匀；(7)分别于1、2、4 h吸出培养基，用PBS小心冲洗除去未粘附的细胞，每孔加入CCK-8试剂300 μL(动作应轻柔以免避免产生气泡)，放入细胞培养箱中避光孵育2 h；(8)将孔板取出，每孔吸取100 μL液体至新的96孔板中，避光，调设酶标仪参数，设置450 nm波长，测定各孔吸光度值(OD值)。

1.5.2 细胞增殖实验 细胞培养、种板步骤与细胞粘附实验步骤(1)～(6)相同。种板后将48孔板放入CO2孵箱培养，分别培养1、3、7 d后取出样品，吸出培养基，用PBS小心冲洗除去未粘附的细胞，每孔加入CCK-8试剂300 μL(动作应轻柔以免产生气泡)，放入细胞培养箱中避光孵育2 h。后续步骤与1.5.1步骤(8)相同。

1.5.3 DAPI染色实验 将样品放于24孔板中，每孔1个样品，取BMSCs细胞悬液，以2×105个/孔的密度接种于24孔板中，共培养24 h后去离子水漂洗2～3遍，转移至新的24孔板，每孔加入适量多聚甲醛固定5 min后，吸弃固定液并用去离子水漂洗2～3遍，加入DAPI试剂染色20 min。吸弃染色液，去离子水漂洗2遍后置于倒置荧光显微镜下观察。

1.5.4 ALP活性检测 将样品放于24孔板中，每孔一个样品，取BMSCs细胞悬液，以2×105个/孔的密度接种于24孔板中，共培养7、14 d后取出样品，去离子水漂洗2遍后放于新24孔板，每孔加入曲拉通X-100细胞裂解液60 μL，裂解30 min，吹打收集裂解液后12 000×g高速低温离心20 min，收集上清液按说明书检测。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 理化性能

2.1.1 表面形貌分析 扫描电镜观察各组样品表面结构(图1)，可见除Ti组外各组表面有大量微球状结构。Ti组表面未见明显微球。B组表面可见大量微球，相互间有所融合；PDA组微球数量明显减少，形成微纳米级的网状表面结构。B-PDA组表面较均匀，微球数量与PDA组相似，表面的网状结构更加均匀。高倍镜下可见B组微球结构清晰，相互融合处可见少量裂纹；PDA组网状结构内可见不平整表面，B-PDA组的网状结构更为致密，中间孔隙较PDA组少。

图1 各组钛片表面场发射扫描电镜形貌

2.1.2 亲水性分析 通过接触角测试仪检测4组钛片的接触角(图2)。Ti组、B组、PDA组、B-PDA组的平均接触角分别为(72.07±13.02)°、(68.30±15.57)°、(45.02±19.73)°、(51.37±8.70)°。可见Ti组与B组的接触角较大，亲水性较差，两者之间无统计学差异(P>0.05)；PDA组及B-PDA组亲水性较好，与Ti组、B组相比有统计学差异(P<0.05)；而PDA组的平均接触角最小，与B-PDA组无统计学差异(P>0.05)。

图2 各组接触角

A：B组的N1s区域；B：PDA组的N1s区域；C：B-PDA组的N1s区域；D：B组的O1s区域；E：PDA组的O1s区域；F：B-PDA组的O1s区域

2.2 生物学评价

2.2.1 BMSCs粘附实验 BMSCs粘附实验结果表明(表1)，BMSCs在各组支架上均具有粘附能力，其中1、2 h时PDA组的细胞数目较其余三组少，差异有统计学意义(P<0.05)；2 h时B组及B-PDA组的细胞数目较Ti组多，差异有统计学意义(P<0.05)；4 h时Ti组比B-PDA组的细胞数目多，差异无统计学意义(P>0.05)；Ti组与B-PDA组的细胞数目比B组、PDA组多，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组钛片表面骨髓间充质干细胞粘附的CCK-8吸光度值

2.2.2 BMSCs增殖实验 OD值提示(表2)，BMSCs在各组钛片上生长1、3、7 d均能持续增殖，B-PDA组的增殖速度最快，B组次之，与Ti组、PDA组均有统计学差异(P<0.05)。在1、7 d时，Ti组与PDA组增殖速度无统计学差异(P>0.05)。在3 d时，PDA组增殖最慢，有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组钛片表面骨髓间充质干细胞增殖的CCK-8吸光度值

2.2.3 DAPI染色结果 DAPI染色后倒置荧光显微镜观察可见4组的细胞形态(图4)。钛片上细胞核呈明亮的蓝色，形态为圆形或椭圆形，细胞核体积基本一致。细胞呈梭形，均有伸出丝状足，且四组的细胞密度均较为密集，细胞形态良好，负载聚多巴胺或黄芩苷与纯钛组相比，细胞形态改变不明显。

图4 DAPI染色后各组钛片表面BMSCs形态( ×100)

2.2.4 BMSCs中ALP活性检测 在第7天时，B-PDA组的细胞内ALP活性高于Ti组、B组、PDA组(P<0.05)；第14天时，B组、B-PDA组的细胞内ALP活性均显著高于Ti组、PDA组(P<0.05)，而PDA组的细胞内ALP活性较另外三组低(P<0.05)(表3)。

表3 培养7、14 d各组BMSCs的ALP活性

3 讨 论

口腔种植体常用的材料是钛基金属，属于惰性金属，存在生物活性差、缺乏骨诱导等特点，与机体骨组织之间主要为机械结合[9]。对骨种植体表面进行处理是影响骨结合的重要因素[4]，短时间内使植入体与周围骨组织发生结构和功能上的“骨整合”是保证植入体种植成功的关键[10]。因此，许多研究通过物理改性、化学改性或生物化学改性等方法，改变纯钛金属表面的生物活性，增强种植体与机体的骨结合[11]。

另外，有研究表明，黄芩苷具有影响成骨细胞和破骨细胞活动、促进新骨形成和减少骨吸收的作用[7]。从本实验CCK-8检测的OD值可见，BMSCs在各组材料上都随时间的延长而持续粘附增殖。在粘附实验中，培养2 h后实验组OD值高于对照组，存在统计学差异(P<0.05)；4 h后实验组(B-PDA组)的OD值与对照组(Ti组)无统计学差异(P>0.05)。可能是由于实验组能促进细胞更快地粘附，而在4 h时细胞密度接近饱和，使对照组的OD值接近实验组。这说明实验组可能对BMSCs的粘附有一定的促进作用。在增殖实验中，培养1、3、7 d后的实验组(B-PDA组)的OD值均比对照组高(P<0.05)，提示负载聚多巴胺-黄芩苷复合涂层可促进BMSCs的增殖。而PDA组在粘附、增殖方面均体现出抑制作用，考虑可能是制备PDA涂层时仍有部分多巴胺单体未完全聚合残留于钛片表面，而多巴胺单体对细胞具有一定的抑制作用，也因此影响了PDA组的粘附、增殖实验的结果[21]，这可能也是导致ALP实验中PDA组的实验结果较另外三组偏低的原因。

ALP实验的结果可以看出，在7 d时，B-PDA组的细胞内ALP活性高于Ti组、B组、PDA组(P<0.05)，说明实验组可促进BMSCs的成骨向分化；在14 d时，B组、B-PDA组的细胞内ALP活性均显著高于Ti组、PDA组(P<0.05)，进一步提示影响BMSCs成骨向分化的主要涂层物质为黄芩苷，这一结果与之前的研究结果一致[22]。

本实验结果表明，通过共沉积法负载聚多巴胺-黄芩苷的复合涂层可改善纯钛金属表面的亲水性，提高其生物相容性，并促进BMSCs的成骨向分化。然而本实验仍未深入探讨该涂层影响BMSCs增殖分化的信号通路，以及不同浓度的黄芩苷、聚多巴胺负载的对比。可以作为未来研究深入的方向，为今后种植体表面处理、中药涂层负载的方法提供新的思路。