铁皮石斛多糖对癫痫大鼠认知功能及海马神经元凋亡的影响

周宾 冯涛 刘晓 任仙

癫痫由脑部神经元同步化异常放电、神经兴奋性异常增高所致，具有短暂性、发作性以及重复性等特点，持续反复发作可损伤脑组织，引起认知功能障碍，影响患者正常生活和工作，并可增加意外事件发生风险[1]。癫痫发作早期神经元损伤具有可逆性，通过相应治疗可挽救受损细胞，发作中晚期，神经元损伤转变为不可逆性，治疗只能挽救部分神经元，因此在癫痫发作早期应及时采用药物治疗防治癫痫发作[2]。传统药物治疗癫痫，可在一定程度缓解患者症状，但治疗效果有限，部分患者甚至症状加重，产生认知及情感障碍等并发症。研究结果显示，大麻二酚、地塞米松等具有抗炎作用，可降低癫痫发作频率，这为靶向炎症治疗阻止癫痫进展提供了新思路[3-4]。铁皮石斛多糖(dendrobium officinale polysaccharides，DOP)为传统中药铁皮石斛主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等作用[5]。目前，有关DOP在抗癫痫方面的研究尚少，其在抗癫痫中的作用机制尚不明确。该研究探讨了DOP抗癫痫作用及其可能机制，为临床治疗癫痫提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物SPF级Wistar雄性大鼠85只，7周龄，体质量200～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。置22℃～25℃、相对湿度50%～70%的清洁通风环境饲养，12 h/12 h明暗交替，自由进食饮水，适应性饲养7 d。实验过程符合3R原则。

1.2 主要试剂DOP为西安中科达生物科技有限公司产品，大鼠白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗大鼠核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)p65、p-NF-κB p65，NF-κB抑制蛋白α(NF-κB inhibitor protein alpha，IκBα)、p-IκBα、p-NF-κB p65、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2gene，Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assoaciated X protein，Bax)一抗以及HRP标记的二抗购自美国Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1癫痫模型制备：随机取70只大鼠制备癫痫模型，余15只大鼠为对照组。给予模型组大鼠按体重127 mg/kg腹腔注射氯化锂，20 h后按体重1 mg/kg皮下注射东莨菪碱，30 min后按体重50 mg/kg腹腔注射毛果芸香碱。对照组大鼠腹腔注射生理盐水。采用Racine分级[6]标准判定癫痫发作级别，4级持续30 min以上进入癫痫持续状态(status epilepticus，SE)视为建模成功，SE持续2 h后，按体重10 mg/kg腹腔注射地西泮终止癫痫。最终建模成功64只，随机分为癫痫模型组、丙戊酸钠组及DOP低、高剂量组，各16只。造模成功当天，分别给予DOP低剂量(200 mg/kg)组、DOP高剂量(400 mg/kg)组和丙戊酸钠组(0.94 g/kg)灌胃干预，1次/d，连续4周，对照组和癫痫模型组按相同方式给予等量生理盐水。

1.3.2行为学观察：末次干预12 h后，观察各组大鼠癫痫发作情况，记录首次发作潜伏期(末次干预12 h开始至首次出现4级以上癫痫发作时间)。

1.3.3Morris水迷宫实验：行为学观察后，采用Morris水迷宫实验检测大鼠认知能力。(1)定位航行实验(测试学习能力)：将大鼠放至任一入水点，游至平台时间即为逃避潜伏期，若未能在120 s内游至平台，则引导其爬至平台，连续训练5 d，记录第6天逃避潜伏期。(2)空间探索实验(测试空间记忆能力)：第7天撤去平台，以距平台最远象限为入水点，记录大鼠120 s内穿越平台次数。

1.3.4海马组织炎症因子检测：每组随机取5只大鼠，腹腔注射1%(质量浓度)戊巴比妥钠麻醉，断头取脑，分离海马组织，制备组织匀浆。按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，采用酶标仪检测450 nm处吸光度值，根据标准曲线计算IL-1β、TNF-α水平。

1.3.5海马神经元存活情况：每组随机取5只大鼠，剥离海马组织，以4%(质量浓度)多聚甲醛固定72 h，石蜡包埋，切片(片厚4 μm)，二甲苯透明、酒精脱水，Nissl染色液37℃染色30 min，水洗，风干，二甲苯透明，中性树胶封片，置显微镜下观察并计数存活神经元数目。

1.3.6TUNEL染色：取海马切片，脱蜡至水，加入3%(质量分数)H2O2反应5 min，依次加入蛋白酶K孵育30 min，TUNEL液孵育60 min，3%(质量浓度)BSA孵育20 min，POD转换液反应30 min，DAB显色，苏木素复染。置显微镜下观察神经元凋亡情况，并计算凋亡指数(棕色凋亡细胞数/细胞总数×100%)。

1.3.7Western blot检测：处死各组剩余大鼠，剥离海马组织，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；蛋白变性，上样，电泳，转膜；将膜放入5%(质量浓度)脱脂奶粉室温封闭2 h，加入 1∶1000稀释的IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax一抗，4℃孵育过夜，洗膜，加入二抗室温孵育1 h，洗膜；ECL发光，扫描图片。计算目的蛋白相对表达水平(目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值)。

1.4 统计学处理采用SPSS 25.0软件进行统计学处理，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两均数间比较采用t检验；多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。取α=0.05。

2 结果

2.1 各组癫痫发作潜伏期比较与癫痫模型组比较，DOP低剂量组、DOP高剂量组和丙戊酸钠组发作潜伏期延长(P<0.05)；与DOP低剂量组比较，DOP高剂量组和丙戊酸钠组发作潜伏期延长(P<0.05)；DOP高剂量组和丙戊酸钠组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

2.2 Morris水迷宫实验结果与对照组比较，癫痫模型组大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；与癫痫模型组比较，DOP低剂量组、DOP高剂量组和丙戊酸钠组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加(P<0.05)；与DOP低剂量组比较，DOP高剂量组和丙戊酸钠组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加(P<0.05)；DOP高剂量组和丙戊酸钠组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠癫痫发作潜伏期和Morris水迷宫检测结果比较

2.3 海马组织IL-1β和TNF-α水平比较与对照组比较，癫痫模型组海马组织IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；与癫痫模型组比较，DOP低剂量组、DOP高剂量组和丙戊酸钠组IL-1β、TNF-α水平降低，DOP高剂量组和丙戊酸钠组低于DOP低剂量组(P<0.05)；DOP高剂量组和丙戊酸钠组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

2.4 海马神经元细胞存活情况与对照组比较，癫痫模型组海马神经元存活数减少，神经元凋亡指数高(P<0.05)；与癫痫模型组比较，DOP低剂量组、DOP高剂量组和丙戊酸钠组海马神经元存活数增加，凋亡指数降低(P<0.05)；与DOP低剂量组比较，DOP高剂量组和丙戊酸钠组神经元存活数高，凋亡指数低(P<0.05)；DOP高剂量组和丙戊酸钠组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2、图1～2。

表2 各组大鼠海马组织炎性因子及神经元存活情况比较

注：A：对照组；B：癫痫模型组；C：DOP低剂量组；D：DOP高剂量组；E：丙戊酸钠组图1 各组大鼠海马CA1区神经元存活情况(Nissl染色)

注：A：对照组；B：癫痫模型组；C：DOP低剂量组；D：DOP高剂量组；E：丙戊酸钠组图2 各组大鼠海马CA1区神经元凋亡情况(TUNEL染色)

2.5 海马组织蛋白表达与对照组比较，癫痫模型组海马组织p-IκBα、p-NF-κB p65、Bax蛋白表达高，Bcl-2蛋白表达低(均P<0.05)；与癫痫模型组比较，DOP低剂量组、DOP高剂量组和丙戊酸钠组p-IκBα、p-NF-κB p65、Bax蛋白表达低，Bcl-2蛋白表达高(P<0.05)；与DOP低剂量组比较，DOP高剂量组和丙戊酸钠组p-IκBα、p-NF-κB p65、Bax蛋白表达低，Bcl-2蛋白表达高(P<0.05)；DOP高剂量组和丙戊酸钠组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3、图3。

图3 各组大鼠海马组织蛋白表达电泳图(Western blot)

表3 Western blot法检测各组大鼠海马组织相关蛋白表达

3 讨论

研究结果显示，癫痫患者脑组织炎症因子水平明显升高，并可与神经元相互作用，促进癫痫进入恶性循环[7]。癫痫发作后，患者可出现不同程度认知受损。动物模型证实癫痫发作后其空间记忆能力及探索行为明显下降[8-9]。海马组织参与记忆、情感等重要认知功能，其神经元损伤可引起海马结构完整性丢失，是导致海马相关认知功能下降的重要原因之一[10]。炎症与癫痫进展及严重程度密切相关，干扰炎症通路可为治疗癫痫提供新的治疗途径。

炎症及癫痫均可激活中枢神经系统，分泌大量IL-1β和TNF-α等活性物质，增加海马神经元兴奋毒性，诱导细胞凋亡，导致海马组织丢失，引发认知功能障碍，干扰炎症通路可能为治疗癫痫提供新的治疗途径。既往研究证实，DOP在慢性萎缩性胃炎及结肠炎动物模型中具有明显抗炎作用[11-12]。该研究结果显示，模型组大鼠处于癫痫发作期，经治疗后，DOP低、高剂量组和丙戊酸钠组海马组织炎症因子水平下降，发作潜伏期延长，学习记忆能力提高，海马神经元存活数目增加，凋亡减少，且DOP高剂量组和丙戊酸钠组效果无统计学差异，提示DOP可减轻癫痫大鼠脑组织炎症，改善海马神经元损伤，维持海马认知功能，发挥抗癫痫作用。另有研究显示，DOP可抑制海马小胶质细胞活化，改善阿尔兹海默病小鼠认知功能，表明DOP具有神经保护作用[13]。由此推测DOP通过抑炎作用保护神经海马神经元，发挥抗癫痫效果，然而其确切机制尚不清楚。

NF-κB在炎症反应及细胞凋亡等过程中发挥重要作用。典型NF-κB是由p50和p65组成的异源二聚体，p50结合DNA，p65参与调节基因转录。IκBα参与调节NF-κB活性，静息状态下，NF-κB二聚体与IκBα结合成无活性三聚体存在于细胞质内，阻止NF-κB与DNA结合。当神经系统受到IL-1β、TNF-α等因素刺激时，IκBα磷酸化活化后被降解，NF-κB解离进入细胞核，p65磷酸化活化，参与调节靶基因转录。NF-κB通路参与癫痫发生发展过程，针对癫痫患者术后脑组织切片的研究显示，海马组织中NF-κB过度表达，表明NF-κB参与癫痫形成过程，推测其介导的炎症反应参与海马神经元损伤，导致认知功能障碍，与癫痫进展密切相关[14-15]。抑制NF-κB信号通路，可减少大鼠海马神经元凋亡，减轻神经损伤[16]。Bcl-2和Bax基因属于Bcl-2家族，分别为抑凋亡基因和促凋亡基因，二者可结合形成同源或异源二聚体参与调节细胞凋亡。该研究结果显示，癫痫模型组大鼠NF-κB信号通路被激活，Bax表达升高，经DOP和丙戊酸钠治疗后，p-IκBα和p-NF-κB p65表达明显下降，Bcl-2表达升高，Bax表达下降，提示DOP可能通过抑制NF-κB信号通路减轻炎症反应，减少神经元细胞凋亡，发挥抗癫痫作用。NF-κB通路在癫痫中发挥重要作用，抑制该通路可为治疗癫痫寻找新的治疗靶点[17]。

综上所述，该研究结果显示，DOP可明显改善癫痫大鼠认知功能，减轻海马炎症反应，减少神经元凋亡，保护神经元细胞，发挥抗癫痫作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关，这为临床治疗癫痫提供了新的靶点和实验依据。