NSCLC组织中8-OHdG、p53的表达与患者临床病理特征及预后的关系

贠宇辉，景 鑫，杨恩德

空军军医大学唐都医院/空军军医大学第二附属医院胸腔外科，陕西西安 710038

肺癌是当今最常见的癌症，病死率极高，而吸烟是肺癌发病的主要原因，但其影响肺癌发生、发展的机制目前尚未明确[1]。有研究报道吸烟是氧化应激的主要诱因，而氧化应激可以导致DNA损伤和肿瘤相关基因突变[2]，因此吸烟可能通过引起氧化应激反应而导致肿瘤发生、发展。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是公认的氧化应激标志物，由于其只能通过DNA氧化损伤途径形成，且可以在体内稳定存在而不受饮食等因素影响，很容易被检测到，因此被用于评估氧化应激的产生[3]。曾有研究报道8-OHdG在癌症中的表达增加与预后不良有关[4]。但也有研究表明，在乳腺癌患者血清和癌组织中8-OHdG的低表达反而与乳腺癌的浸润性相关，而且8-OHdG低表达的患者生存率会更低[5]。因此8-OHdG表达作为一种生物标志物的临床意义仍存在争议，且目前关于非小细胞肺癌(NSCLC)组织中8-OHdG表达的研究尚少。

人抑癌基因p53是调控细胞活性、DNA修复和凋亡的重要转录因子。p53突变是在肺癌中发现的最常见的突变之一，且在吸烟导致的肺癌中更为常见[6]。在烟草的烟雾颗粒中存在60多种致癌物可以导致基因突变，p53的突变导致DNA的修复能力受损，从而促使癌症加剧[7]。有研究发现恶性黑色素瘤p53阳性表达患者中，8-OHdG的阳性免疫反应较多[8]。因此，本研究应用免疫组织化学方法检测8-OHdG、p53在NSCLC组织中的表达水平，并分析二者与吸烟等临床病理特征和患者预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2007年1月至2015年12月在本院接受手术治疗的203例NSCLC患者作为研究对象，收集患者的完整住院病历资料及手术切除的组织标本。组织标本经10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，标本用H&E染色后，至少由2名病理医师完成组织学诊断，术后均经病理证实为NSCLC。203例患者中男147例(72.4%)，女56例(27.6%)，中位年龄65岁；吸烟79例，不吸烟124例。按照世界卫生组织2015年肺肿瘤组织学分类，鳞癌94例，腺癌109例；按国际肺癌研究协会第8版TNM分期标准进行T分期和N分期，T1+T2期119例、T3+T4期84例，N0期108例、N1期95例。

1.2主要试剂 8-OHdG抗体购自美国密理博公司，Ki-67抗体(DAKO)、鼠抗人单克隆抗体p53、免疫组织化学超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒、DAB试剂盒(20×)均购自福建迈新生物技术开发有限公司。

1.3免疫组织化学染色与评分 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法，进行8-OHdG、p53和Ki-67染色。组织切片脱蜡水化后，用柠檬酸盐(pH值6.0)的抗原提取液在蒸煮器中煮沸20 min进行抗原修复。用8-OHdG抗体(1∶200)、p53抗体(1∶800)和Ki-67抗体(1∶100)进行免疫组织化学染色。DBA显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，最后脱水、透明、封片观察。空白对照组一抗用磷酸盐缓冲液(PBS)代替，具体操作步骤按照免疫组织化学超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒说明进行。

根据细胞核染色程度及阳性细胞率对免疫组织化学染色进行评价，8-OHdG和Ki-67的免疫组织化学染色在≥10%时为阳性。p53的免疫组织化学结果根据文献[9]分为3类：阴性表达、低表达(1%～50%阳性染色核)、高表达(>50%阳性染色核)，根据该文献将p53免疫组织化学染色结果p53高表达定义为异常表达，p53低表达定义为野生型表达。

1.4随访 通过电话、门诊、住院等方式随访，在手术治疗后的首2年内，每3个月进行1次随访，随后每6个月随访1次。最后1次随访的日期记录为截至2020年12月或患者死亡。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验；绘制Kaplan-Meier生存曲线，采用Log-rank检验比较不同临床病理特征NSCLC患者的总生存率；采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析影响NSCLC患者生存期的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1NSCLC患者不同临床病理特征与8-OHdG表达的关系 免疫组织化学染色结果显示，83.3%(169/203)的NSCLC组织呈8-OHdG阳性表达，且8-OHdG仅在肿瘤细胞核中表达。8-OHdG阴性表达与男性、鳞癌、T分期高、N1期、吸烟有关(P<0.05)；吸烟患者8-OHdG的阳性表达率为73.4%，低于不吸烟患者的89.5%(P<0.05)，见表1。

表1 NSCLC患者不同临床病理特征与8-OHdG表达水平的关系[n(%)]

续表1 NSCLC患者不同临床病理特征与8-OHdG表达水平的关系[n(%)]

2.2NSCLC患者不同临床病理特征与p53表达水平的关系 p53免疫组织化学结果显示，p53野生型表达占29.6%(60/203)，p53异常表达占70.4%(143/203)。p53异常表达与男性、鳞癌、吸烟及Ki-67阳性表达有关(P<0.05)；吸烟患者p53野生型表达率为13.9%，低于不吸烟患者的39.5%(P<0.05)，吸烟患者的P53异常表达率为86.1%，高于不吸烟患者的60.5%(P<0.05)；8-OHdG阴性表达的患者中p53异常表达率为82.4%，高于8-OHdG阳性表达患者的68.0%，但差异无统计学意义(P>0.05)；p53野生型表达和p53异常表达在肿瘤分期上差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 NSCLC患者不同临床病理特征与p53表达水平的关系[n(%)]

续表2 NSCLC患者不同临床病理特征与p53表达水平的关系[n(%)]

2.3影响NSCLC患者生存期危险因素的单因素Cox比例风险回归模型分析 采用单因素Cox比例风险回归模型对NSCLC患者临床病理特征进行分析，结果显示，年龄≥65岁、男性、吸烟、T分期高、N1分期、8-OHdG阴性表达、p53异常表达及Ki-67阳性表达是影响NSCLC患者生存期的危险因素，见表3。

表3 NSCLC患者生存期危险因素的单因素Cox比例风险回归模型分析

203例NSCLC患者随访至2020年12月，结果显示，死亡84例，生存119例，绘制不同临床病理特征NSCLC患者的Kaplan-Meier生存曲线，采用Log-Rank检验分析，结果显示，8-OHdG阴性表达、p53异常表达、Ki-67阳性表达、吸烟及T分期高的患者总生存率更低(P<0.05)，见图1。

2.4影响NSCLC患者生存期危险因素的多因素Cox比例风险回归模型分析 采用多因素Cox比例风险回归模型对单因素分析中有统计学意义的危险因素进行分析，结果显示，年龄≥65岁、吸烟和T分期高是影响NSCLC患者生存期的独立危险因素(HR=2.154、2.371、2.346，P<0.05)，而8-OHdG阴性表达和p53异常表达并不是影响NSCLC患者生存期的独立危险因素(HR=1.486、1.211，P>0.05)，见表4。

表4 NSCLC患者生存期危险因素的多因素Cox比例风险回归模型分析

注：A、B、C、D、E表示不同8-OHdG、p53、Ki-67表达及吸烟与否、T分期高低的生存曲线。

3 讨 论

本研究通过免疫组织化学分析观察8-OHdG和p53在NSCLC组织中的表达情况，结果表明，83.3%的NSCLC患者组织中存在8-OHdG阳性表达，其中8-OHdG的阴性表达与男性、鳞癌、T分期高、N1期、吸烟有关(P<0.05)，p53异常表达与吸烟、男性、鳞癌及Ki-67阳性表达有关(P<0.05)，但8-OHdG阴性表达和p53异常表达不是NSCLC患者生存期的独立危险因素(P>0.05)。

有研究表明吸烟是引起氧化应激的重要原因，而氧化应激会导致严重的DNA损伤，这是NSCLC的重要致癌机制[2,10]。体内大量活性氧(ROS)的产生是氧化应激发生的主要原因，ROS的寿命较短，可以通过细胞防御机制快速降解和去除，所以直接测定ROS来评估氧化应激水平十分困难[10]。8-OHdG是ROS引起DNA损伤后产生的代谢终产物，在细胞内可以维持55 min不被清除，所以8-OHdG是目前公认的氧化应激生物标志物[3]。8-OHdG表达的增加与人体衰老及一些病理过程有关，包括癌症、糖尿病和高血压等，现已发现其在肺癌、肝癌、前列腺癌和胃癌等多种癌症中均有表达[3-4]。然而，对于8-OHdG作为癌症反应的生物标志物仍然存在争议，因为有研究表明8-OHdG的阴性表达与乳腺癌的侵袭性表型有关，且与更差的预后有关[11]。这与本研究发现的8-OHdG阴性表达与NSCLC患者较差的临床病理特征和生存期密切相关一致。目前对出现这种相反结果的原因进行探讨的研究尚少，SOVA等[12]认为肿瘤组织中ROS的过量产生会引起抗氧化酶的过量表达，从而刺激肿瘤细胞的抗氧化防御能力增强而避免由ROS引起的肿瘤细胞的凋亡和坏死，使肿瘤得以继续发展。同时抗氧化酶阻止ROS对DNA的损伤作用而导致8-OHdG水平下降[13]。因此，这也可能是本研究中8-OHdG阴性表达的NSCLC患者预后较差的原因之一。因此，对8-OHdG在癌症发生、发展中相关机制的研究还需要继续进行，这对可能把8-OHdG作为NSCLC治疗的生物标志物有重大意义。

本研究还发现，8-OHdG的阴性表达与患者吸烟相关(P<0.05)，然而目前可以解释吸烟与8-OHdG阴性表达间关系的机制尚不明确。但是，根据SOVA等[12]的研究理论可以得出吸烟引起8-OHdG表达水平下降可能是氧化应激在整个过程中发挥了重要作用的结果。因为烟草中含有的致癌物会诱导自由基和ROS的形成从而引起氧化应激反应，而氧化应激反应的一系列机制引起8-OHdG表达水平下降[14]。这可能是解释吸烟与8-OHdG阴性表达间关系的机制之一，但是其中是否还存在其他相关机制还有待进一步研究。

p53突变是肺癌与吸烟有关的一种重要突变，其导致野生型p53功能丧失和突变p53功能增强，是NSCLC产生的重要原因[6]。有研究报道p53的免疫组织化学染色可以作为p53突变分析的代替品，因为野生型p53的半衰期很短，蛋白非常不稳定而难以被测定，而突变的p53在细胞中的表达蛋白可以比较稳定地存在，所以如果在组织或细胞中检测到p53的过表达，则可以判定p53发生了突变[15]。在本研究中，将p53免疫组织化学染色结果分为野生型表达和异常表达，并且分析了p53表达与NSCLC患者的临床病理特征的相关性。有研究对腺癌和鳞癌中p53的表达进行分析，发现p53在鳞癌和腺癌中的异常表达率分别为81%和46%[7]，与本研究中鳞癌的p53异常表达率高于腺癌一致。另外，p53异常表达与吸烟、男性、鳞癌和Ki-67阳性表达密切相关(P<0.05)。

综上所述，本研究证实了8-OHdG阴性表达和p53异常表达与吸烟和较差的预后有关，但二者不是影响NSCLC患者生存期的独立危险因素，其为NSCLC患者的治疗及预后判断提供了重要的依据。