老年细菌性肺炎痰标本的临床应用价值：基于16S rDNA测序方法*

穆 汇，邹 盈，周奇兴，孙 妍，胡 江△

上海市普陀区利群医院：1.检验科；2.呼吸科，上海 200333

细菌性肺炎是临床上常见的疾病之一，发病率高，危害性大，是老年人死亡的主要原因[1-3]。下呼吸道标本取样应用最广泛、最简便的方法为自然咳痰法，尤其老年患者。此法无创、标本易获得，然而其影响因素较多，尤其易受上呼吸道正常定植菌群的影响，且痰培养阳性率不高，因此，目前有学者认为采用传统方法检测下呼吸道感染患者自然咳痰的标本对临床用药指导意义不大。本研究通过自然咳痰(SH组)、纤维支气管镜吸痰(XT组)、纤维支气管镜肺泡灌洗液(XC组)3种方式获得老年细菌性肺炎患者呼吸道标本，采用16S rDNA高通量测序技术，检测3种类型呼吸道标本，并从细菌丰度及其组成结构的角度，比较3种呼吸道标本细菌检测结果，评估质量合格的呼吸道标本在临床上的应用价值。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取本院2018年7月至2019年3月呼吸科收治的肺炎患者作为研究对象，男女性别不限，年龄≥65岁，分别留取每个患者的SH组、XT组和XC组标本。纳入标准：患者诊断均符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)》[4]中的细菌性肺炎诊断标准。呼吸道标本质量检测合格标准为：平均每低倍视野鳞状上皮细胞数<10个，白细胞数>25个。筛选出诊断和呼吸道标本质量均符合要求的患者10例，均为上海本地西北地区人，其中男4例、女6例，平均年龄为(72.5±7.2)岁，平均体质量指数(BMI)为(24.66±2.75)kg/m2，患者受试期间均无冶游史。

1.2检测方法

1.2.1标本采集 采集初诊为肺炎的老年患者SH组、XT组及XC组标本。XT组和XC组标本的采集由气管镜室工作人员行纤维支气管镜检查时吸痰获得，同时给予100 mL无菌生理盐水冲洗并回收获得肺泡灌洗液。评估患者呼吸道标本质量，选取符合标准的10例患者共30份标本于-80 ℃保存，然后送合作公司进行测序并分析。

1.2.216S rDNA高通量测序和生物信息学分析 使用美国Omega Bio-Tek公司的DNA抽提试剂盒提取30份标本的基因组DNA，在Illumina公司的Miseq PE300平台对16S V3～V4区进行测序，得到优化序列后进行群落聚类(OTU)分析，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，获得OTU丰度表，进而展开生物信息学分析。

1.3统计学处理 采用Excel2016对数据进行统计。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验；维恩(Venn)图分析采用R语言工具统计和作图；非度量多维尺度分析(NDMS)采用QIIME计算BETA多样性距离矩阵，采用R语言vegan软件包进行分析和作图，当应力系数(Stress)<0.2时可用NMDS的二维点图表示，其图形有一定的解释意义；当Stress<0.1时，可认为是一个好的排序；当Stress<0.05 时，则具有很好的代表性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.116S rDNA高通量测序序列分析 本研究细菌16S rDNA高通量测序的比对数据库为Silva，30例标本的高通量测序一共得到1 503 515条有效优化序列，562 872 365 bp有效碱基数，标本序列的有效长度平均为374 bp。对OTU进行物种分类学注释，统计每个标本所对应的丰度信息，得到1个域，1个界，48个门，117个纲，309个目，558个科，1 228个属，2 425个种的细菌。

2.2细菌Venn图分析 根据聚类得到的物种分析结果，对SH组、XT组、XC组标本之间共有的、独有的细菌(如属)，绘制成Venn图。SH组、XT组、XC组标本细菌分别为1 113、1 111、1 066个属；3组标本共有的细菌959个属，而各组独有的细菌分别为SH组55个属，XT组47个属，XC组23个属，3组独有细菌的属比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SH组和XC组共有细菌998个属，SH组和XT组共有细菌1 019个属，XC组和XT组共有细菌1 004个属。细菌数目占比较大的属前3位依次为假单胞菌属(23.64%)、土杆菌属(2.77%)、链球菌属(2.75%)，并且假单胞菌属、链球菌属为SH组、XT组、XC组的共有菌属。

2.3NMDS分析 基于Bray-Curtis距离的NMDS分析，比较SH组、XT组、XC组3组标本总体细菌组成的相似性或差异性，并用Qiime计算Beta多样性距离矩阵，采用R语言Vegan软件进行NMDS分析和作图，结果显示，3组标本没有被明显分开，3组在属水平上总体细菌结构差异不明显(Stress<0.2，R<0，P>0.05)，见图1。

注：R>0，说明组间差异大于组内差异；R<0，说明组间差异小于组内差异。

3 讨 论

下呼吸道标本取样应用最广泛、最简便的方法为自然咳痰法，尤其对于老年患者。痰液中培养出的病原菌种类及药敏试验结果对疾病的诊断和指导用药有着重要的意义[5]。自然咳痰法无创、标本易获得，然而其影响因素较多，尤其易受上呼吸道正常定植菌群的影响，因此经常出现致病菌与定植菌难以区分的情况[6]，在临床工作中也往往会遇到用药效果和痰培养药物敏感性试验结果不一致的现象[7]。国内国外学者对痰中分离细菌的价值存在较多质疑，其原因：一方面是阳性率偏低，对临床用药指导意义不大；另一方面患者有明显的感染症状和体征，而痰培养的结果却是阴性。因此，临床医生认为痰培养结果对临床参考价值不大，一般还是经验性地选用抗菌药物。随着分子生物学技术的发展，新一代的测序技术以其高通量、低成本、快速等优点，为开展大规模物种测序等提供了可能。16S rDNA测序技术可以分类鉴定出临床上不能或不易培养的细菌，有可能成为鉴定细菌的主流手段。

本研究采用16S rDNA高通量测序技术，比较了10例65岁及以上细菌性肺炎患者的SH组、XT组及XC组标本共有的、独有的细菌，以及3组标本细菌组成的相似性或差异性。结果发现，3组标本的细菌组成非常相似，根据物种Venn图分析，3组标本共有的细菌959个属；细菌性肺炎的上呼吸道与下呼吸道微生态结构可能呈现一个地貌样延续的状态，SH组、XT组、XC组的细菌分别有1 113、1 111、1 066个属。CABRERA-RUBIO等[8]在一项关于慢性阻塞性肺疾病患者气道微生物多样性的研究中分析了痰、支气管分泌物、支气管肺泡灌洗液、支气管黏膜4种标本的细菌多样性，他们认为相对于痰和支气管分泌物，来自下呼吸道的支气管肺泡灌洗液和支气管黏膜具有非常相似的细菌组成。本研究结论也验证了这个观点，但是对于上呼吸道的痰标本，本研究却提出了不一样的观点，从本研究3组标本在属水平上的Venn图中可以看出，SH组标本独有细菌的属是最多的，3组标本独有细菌的属比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但是在基于Bray-Curtis距离的NMDS分析中发现，3组标本没有被明显分开，Stress=0.085，<0.2，说明3组标本在属水平上总体细菌结构差异不明显。鉴于SH组标本取样方便，采用16S rDNA高通量测序结果准确、信息量丰富，可以满足对大多数下呼吸道感染性疾病的精准治疗，因此，笔者认为质量合格的SH组标本仍然具有一定的临床价值。

在本研究中已经获得了SH组、XT组、XC组的共有细菌，未来拟通过对下呼吸道非感染人群的SH组、XT组、XC组标本进行16S rDNA高通量测序，研究肺炎患者和下呼吸道非感染人群3种类型标本的共有物种，为进一步理解肺炎患者的微生物群落构成和特有病原菌，提供新的认知。这些工作的开展，将会为优化老年人肺部感染疾病的经验用药、预后评判和临床管理，以及更深入地理解该病的发生、发展机制，奠定重要的理论基础。本研究曾尝试收集下呼吸道未被感染且行纤维支气管镜检查患者的标本，如肺癌患者，由于条件限制，样本例数太少，未果。目前已收集了18例健康人的痰液，正在测序中，拟比较细菌性肺炎患者和健康人群的菌群结构和丰度差异。

综上所述，16S rDNA高通量测序SH组标本细菌更丰富，但质量合格的3组标本在属水平上总体细菌结构差异不明显，SH组标本仍有一定的临床价值。