高通量测序在儿童重症肺炎病原学诊断中的应用*

邱梅冰，杨 彤

广西壮族自治区柳州市人民医院儿科，广西柳州 545006

儿童肺炎是5岁以下儿童死亡的最主要原因之一[1-2]，而重症肺炎具有复杂性、缺乏可预测性等特点，且常涉及其他器官的功能障碍，因此具有更高的病死率。早期应用有效的抗感染治疗方案可以改善患儿的预后，而精准的抗感染治疗方案有赖于病原体的检测。迄今为止，儿童重症肺炎感染源的识别仍然是临床的一个主要难题。检测病原体的标本包括血液、咽拭子、痰液及支气管肺泡灌洗液，其中支气管肺泡灌洗液标本的检测常用于重症肺炎患儿的微生物检查[3]。本科室自2019年1月以来征得患儿家长同意后对重症肺炎患儿的肺泡灌洗液实行高通量测序病原体检测，实现了对重症肺炎病原体的精准诊断，为临床抗感染治疗方案的制订提供了精准的依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年1月至2020年1月在本院儿科住院的99例重症肺炎患儿作为研究对象，其中男53例，女46例；年龄1个月至14岁，中位年龄3岁2个月；所有患儿均已在门诊及基层医院给予口服及静脉抗菌药物治疗，入院后均给予经验性抗感染治疗，病原学检测结果回报后根据病情调整抗感染治疗方案；13例应用呼吸机辅助通气治疗，3例使用体外膜肺氧合(ECMO)循环支持治疗；经抗感染及对症支持治疗后，97例患儿好转出院，2例死亡。纳入标准：所有患儿诊断均符合《儿科学》第9版儿童重症肺炎的诊断标准[4]；家属均签署知情同意书，书面同意进行支气管镜及高通量测序等检查；患儿均有支气管镜检的适应证，无禁忌证[5]。

1.2方法 患儿入院第1天在开始经验性抗感染治疗前均进行常规检测，包括血常规、超敏C反应蛋白、降钙素原、肺炎支原体抗体滴度、咽拭子免疫荧光病毒(包括呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、副流感病毒1/2/3型、腺病毒)检测以及血培养，根据病情选择性进行真菌D-葡聚糖等检测。入院后第2天或第3天行支气管镜检查并采集肺泡灌洗液，每例标本分2份，1份送一般细菌涂片及培养检查，另1份送高通量测序检查。高通量测序标本交由深圳华大基因股份有限公司检测，与该公司病原体数据库进行比对，得出报告结果序列数。高通量测序结果判读阳性的标准如下[6]：(1)在属水平上，细菌(不包括结核分枝杆菌)和真菌的相对丰度大于30%；(2)如果至少有一个读数在物种或属水平上与参考基因组一致，则认为结核分枝杆菌呈阳性；(3)当严格的图谱读数(SMRN)不小于3时，认为病毒检测呈阳性；(4)当用传统的病原学检测方法检测到病原体，且高通量测序的序列数大于50时，也可以认为该病原体被检出。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件对数据进行处理。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1传统常规检测结果 99例患儿中白细胞增高20例(18例以中性粒细胞升高为主，2例以淋巴细胞升高为主)，白细胞下降7例；超敏C反应蛋白增高72例；降钙素原增高47例；真菌D-葡聚糖阳性6例；检出病原体66例(66.67%)，其中单一病原体55例，混合病原体11例。临床传统病原学检测检出细菌24例(24.24%)，其中痰培养检出17例(17.17%)，血培养检出4例(4.04%)，痰培养及血培养均检出3例(3.03%)；肺炎支原体抗体滴度检测检出肺炎支原体55例(55.56%)；咽拭子检测检出病毒8例(8.08%)。

2.2肺泡灌洗液涂片及细菌培养结果 肺泡灌洗液涂片检出病原体36例(36.36%)，分别为革兰阳性球菌25例(25.25%)，革兰阴性杆菌1例(1.01%)，革兰阳性球菌及阴性杆菌混合9例(9.09%)，真菌孢子1例(1.01%)。肺泡灌洗液细菌培养检出16例，分别为流感嗜血杆菌7例，肺炎链球菌4例，肺炎克雷伯菌2例，铜绿假单胞菌1例，鲍曼不动杆菌1，嗜麦芽单胞菌1例。

2.3肺泡灌洗液高通量测序病原体检出结果 肺泡灌洗液高通量测序检出病原体97例(97.98%)，包括单一细菌10例，单一病毒17例，单一支原体28例，混合病原体42例(混合有细菌的38例；混合有病毒的25例，混合有肺炎支原体的20例)。检出的细菌为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌及肺炎克雷伯菌，病毒为腺病毒及巨细胞病毒，混合病原体中有腺病毒7型、肺炎支原体、缓征链球菌、肺炎链球菌、产黑色普雷沃菌、嗜血杆菌、烟曲霉。

2.3.1肺泡灌洗液细菌培养与高通量测序细菌检出结果比较 99例肺泡灌洗液标本中，细菌培养检出细菌16例(16.16%)，高通量测序检出细菌48例(48.48%)，2种检测方法均检出细菌12例(12.12%)。肺泡灌洗液高通量测序的细菌检出率高于细菌培养的细菌检出率(P<0.05)，见表1。

表1 肺泡灌洗液细菌培养与高通量测序细菌检出结果比较(n)

2.3.2咽拭子和肺泡灌洗液高通量测序病毒检出结果比较 99例咽拭子标本中检出病毒8例(8.08%)，肺泡灌洗液高通量测序检出病毒42例(42.42%)，2种检测方法均检出病毒5例(5.05%)。肺泡灌洗液高通量测序的病毒检出率高于咽拭子的病毒检出率(P<0.05)，见表2。

表2 咽拭子和肺泡灌洗液高通量测序病毒检出结果比较(n)

2.3.3血清肺炎支原体抗体滴度检测与肺泡灌洗液高通量测序肺炎支原体检出结果比较 肺炎支原体抗体滴度检测，99例患儿中检出肺炎支原体55例(55.56%)，肺泡灌洗液高通量测序检出肺炎支原体48例(48.48%)，2种检测方法均检出肺炎支原体36例(36.36%)。肺泡灌洗液高通量测序的肺炎支原体检出率低于血清肺炎支原体抗体滴度检测的检出率，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 血清肺炎支原体抗体滴度检测与肺泡灌洗液高通量测序肺炎支原体检出结果比较(n)

2.3.4传统培养方法与高通量测序真菌检出结果比较 血液、痰、肺泡灌洗液标本传统培养均未检出真菌，高通量测序检出真菌4例，主要为烟曲霉。

3 讨 论

重症肺炎是儿科常见危重疾病，由于其病情进展迅速、并发症多，可累及多系统多器官，在临床上有较高的病死率。重症肺炎的常见病原体包括细菌、病毒、真菌、支原体等，重症肺炎可由单一病原体引起，也可由混合病原体引起。尽快明确引起重症肺炎的病原体是实现精准抗感染治疗的前提。尽管有全面的检测方法，但高达60%的患儿没有检测到病原体[7]。在病原体未明前，经验性使用抗菌药物通常作为最初的抗感染治疗。经验性抗菌药物治疗通常缺乏针对性，广谱抗菌药物可能导致抗菌药物耐药性的出现；如为病毒感染，则导致不必要的广谱抗菌药物使用，诱导抗药性，并增加医疗成本。目前临床上采用的传统病原学检测方法包括病原体培养、抗原抗体检测等。目前这些传统的病原体检测技术均无法为临床精准的抗感染治疗提供依据，临床上迫切需要一种可以较快速且精准的病原学检测手段。

近年来随着高通量测序技术的发展，人们能够检测、鉴定甚至量化定值在人类消化道或呼吸管腔的原核或真核微生物群落。高通量测序技术，其原理在于直接从临床标本中提取全部病原体的DNA或RNA，利用基因组学的研究策略研究标本中所包含的全部病原体的遗传组成及其群落功能，通过同源序列比对以筛查鉴定病原体。这种方法不需要病原体的分离培养，可实现在数小时到数天的单一测序过程中从许多样本中产生数据,不仅有效地克服了现有分子诊断技术的缺陷，还为多种病原体(尤其是真菌和病毒)混合感染的检测开辟了新的技术路径[8]。高通量测序技术从引入临床应用后即取得了令人瞩目的成绩[9-12]。高通量测序技术在呼吸系统病原学诊断和鉴定中的应用，特别是在重症肺炎和不明原因感染患儿中的应用越来越广泛。

细菌仍是目前重症肺炎的常见病原体。传统的细菌培养仍然被视为诊断细菌感染的金标准，但它很费时，阳性率不高，而且仅限于特定的病原体检测，并非所有病原体都可以培养。本研究显示，肺泡灌洗液高通量测序细菌检出率为48.48%，高于传统细菌培养方法的细菌检出率(16.16%)，差异有统计学意义(P<0.05)，高通量测序使细菌检出率提高了近2倍。本研究中所有肺泡灌洗液的采集均在使用抗菌药物治疗后1～2 d，提示高通量测序结果不受到先前抗菌药物使用的影响，这与PARIZE等[13]的研究结果一致。高通量测序在混合细菌检出方面也表现良好[8]，本研究中检出混合细菌感染，这是传统细菌培养所不能的。根据高通量测序结果可优化治疗方案和减少药物不良反应，甚至减少医疗费用。

由病毒引起的呼吸道感染是全球人类最常见的疾病之一，病毒不仅能引起轻微的上呼吸道感染，也能引起重症肺炎。而由新型冠状病毒引起的新型冠状病毒肺炎至今仍未得到完全控制，其对全球公共卫生存在巨大威胁[14]。快速和准确地识别病原体，对于选择适当的治疗方法，挽救人们的生命，控制流行病，以及避免不必要地使用抗菌药物很重要。病毒分离培养是诊断病毒感染的金标准,但其灵敏度和特异度差，且费时费力，需要有经验的技术人员进行分析，结果仍不确定，临床上不易开展。常规诊断检测，例如用于快速检测病毒抗体或病毒抗原的测定方法，已在许多临床实验室中广泛应用。本研究提示，咽拭子病毒检出率为8.08%，而肺泡灌洗液高通量测序的病毒检出率为42.42%，较常规检测方法明显升高(P<0.05)。有研究发现病毒合并细菌感染患者的病死率增高[15]，从而突出了快速诊断细菌共感染或重叠感染的重要性。高通量测序在检测病毒合并细菌感染方面显示出巨大的优势[16]。本研究中混合病原体感染有42例，这些病例在高通量测序结果回报后加用针对性抗感染药物治疗后病情得到改善。本研究中2例死亡患儿为腺病毒感染，发生于2019年腺病毒流行季节，初期临床医师对该疾病认识不足，进行肺泡灌洗液高通量测序后明确患儿病原体，调整治疗方法，随后发病率及病死率均降低。

肺炎支原体是儿童社区获得性肺炎的主要病因。近年来，与肺炎支原体相关的重症肺炎病例的报道越来越多[17]。肺炎支原体抗体滴度检测是目前许多基层医院最常用的方法，但这种方法在对不同发病时期采集的血清样本以及使用不同的商业检测试剂盒进行检测时，会产生不一致的结果，具有较高的假阴性率和假阳性率。对某些患儿来说，由于肺炎支原体抗体可持续存在很长时间，故很难确认患儿当前是否存在肺炎支原体现症感染[18]。本研究显示，肺炎支原体抗体滴度检测肺炎支原体检出率为55.56%，而高通量测序检出率为48.48%，即高通量测序法肺炎支原体检出率较肺炎支原体抗体滴度检测的检出率低，与李学清等[19]的研究结果一致。但高通量测序通过检测肺炎支原体的序列数可明确是否为现症感染，还可显示肺炎支原体与其他病原体的共患感染，这是常规检测方法无法实现的。

此外，本研究采用高通量测序检出4例真菌，主要为烟曲霉，而传统病原学检测均未检出真菌。DECKER等[20]对50例真菌脓毒症患儿在其发病后的28 d内连续6个时间点进行了真菌培养、高通量测序，并对血浆β-D-葡聚糖、γ-干扰素、肿瘤坏死因子等指标进行检测，结果提示，高通量测序的诊断方法适用于真菌脓毒症患儿和血培养阴性患儿的真菌病原体鉴定，可弥补常规培养诊断的空白。同时，已证实高通量测序在检测真菌感染方面存在可行性[7]，可为临床及时抗真菌治疗提供重要依据，对改善患儿预后、抢救患儿生命起到非常重要的作用。高通量测序能帮助临床医生快速、准确地诊断原因不明的呼吸系统疾病，但也存在许多挑战，如缺乏通用的结果分析标准和通用的报告解释指南，同时背景病原体与真实病原体的鉴别仍然是临床需要解决的问题[21]。目前高通量测序的成本仍较高(3 500元/例)，需注意选择合适的患儿进行检测。

综上所述，高通量测序能快速、准确地检测和鉴定病原体，有助于及时、准确地治疗儿童重症肺炎。随着医学发展，高通量测序有望为临床儿童重症肺炎精确诊断和治疗提供重要依据。