缺血性脑卒中患者MTHFR基因多态性与颈动脉斑块类型、神经损伤的关系

董丽珍，赵亚军，李梦檀，赵建华

（1.郑州市第二人民医检验科；2.河南省疾病预防控制中心门诊部；3.新乡医学院第一附属医院，河南 郑州 450000）

缺血性脑卒中是临床常见的脑卒中类型，致残率较高，其发病与遗传因素、代谢因素、环境因素等均密切相关。近年来越来越多的临床证据表明，高同型半胱氨酸（Hcy）血症是多种心脑血管事件发生的独立危险因素[1,2]，而亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）在Hcy的代谢过程中有重要作用，其催化活性降低会影响Hcy 代谢并造成Hcy 含量升高。基因多态性是影响MTHFR 催化活性的重要机制，MTHFR基因在第677 位碱基发生C 向T的突变会使基因编码产物的催化活性下降并影响Hcy代谢[3]。已有多项研究报道，心肌梗死患者、颈动脉粥样硬化患者、高Hcy 血症患者体内存在MTHFR基因C677T 位点的多态性[4,5]。为了明确MTHFR基因C677T 位点多态性与缺血性脑卒中发生的关系，本研究分析了缺血性脑卒中患者MTHFR基因C677T 位点多态性的变化及其与颈动脉斑块类型、神经损伤的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年2 月-2018年12 月在我院诊断为缺血性脑卒中的患者作为卒中组，入组标准：⑴经头颅MRI 检查明确诊断为缺血性脑卒中；⑵临床资料完整；⑶首次发病且于发病5日内就诊。排除标准：⑴既往有脑卒中、脑外伤病史；⑵正在服用叶酸、维生素B12 等影响Hcy 代谢药物；⑶既往有恶性肿瘤、结缔组织病、外科手术病史。另取同期体检的健康志愿者作为对照组。卒中组共76例，包括男性46例、女性30例，年龄39～64 岁、平均51.23±8.32 岁；对照组共80例，包括男性58例、女性32例,年龄35～60 岁、平均49.58±9.12 岁。两组间一般资料的比较无显著性差异（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 MTHFR基因多态性的检测 取肘静脉血2mL，采用试剂盒提取基因组DNA 后进行PCR 扩增，MTHFR基因的上游引物序列为5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’、下游引物序列为：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’,经94℃30 s、62℃30s、72℃30s 反应40 个循环后 得到PCR产物，用限制性内切酶Hinf I对PCR 产物进行酶切反应，取酶切产物在琼脂糖凝胶中进行电泳后在凝胶成像仪下观察，产物大小198bp 为CC基因型、175bp 为TT基因型、198bp和175bp 为TC基因型（图1）。

图1 部分患者MTHFR C677T基因多态性的限制性片段长度分析

1.2.2 颈动脉斑块类型的检测 卒中组患者采用彩色多普勒超声诊断仪进行颈动脉超声检查，探头频率5-15MHz，扫查颈总动脉的分叉近2.0cm及颈内动脉、颈外动脉的分叉远1.0cm，测量内中膜厚度、观察斑块特征，由2 名高年资超声科医生判断斑块性质，包括扁平斑块、软斑块、硬斑块、溃疡斑块，其中软斑块和溃疡斑块属于易损斑块，扁平斑块、硬斑块属于稳定斑块。

1.2.3 血清Hcy及神经损伤标志物的检测 取肘静脉血5ml，静置后离心分离血清，采用酶联免疫吸附试剂盒检测Hcy、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、S100B的含量，操作过程均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS21.0 软件录入数据，计数资料的两组间比较采用卡方检验，计量资料的三组间比较采用方差分析,卒中的危险因素采用logistics 回归分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卒中组和对照组MTHFR基因多态性的比较卒中组中基因型TT的构成比及等位基因T的基因频率明显高于对照组（P>0.05），基因型CC的构成比及等位基因C的基因频率明显低于对照组（P>0.05），基因型CT的构成比与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。

表1 卒中组和对照组MTHFR基因多态性的比较

2.2 卒中组中不同MTHFR基因多态性患者Hcy、颈动脉斑块类型、神经标志物的比较 卒中组中MTHFR基因TT基因型患者的血清Hcy、NSE、S100B 含量及颈动脉易损斑块百分比明显高于CT基因型、CC基因型患者（P<0.05），CT基因型患者的血清Hcy、NSE、S100B 含量及颈动脉易损斑块百分比与CC基因型患者比较无显著性差异（P>0.05）。

表2 卒中组中不同MTHFR基因多态性患者Hcy、颈动脉斑块类型、神经标志物的比较

2.3 卒中危险因素的logistics 回归分析 以脑卒中为应变量，MTHFR基因C677T 突变、Hcy 含量、颈动脉斑块类型为自变量进行logistics 回归分析可知，MTHFR基因C677T 纯合突变、高Hcy 血症、颈动脉易损斑块是脑卒中发生的独立危险因素（P<0.05）。

表3 卒中危险因素的logistics 回归分析

3 讨论

高Hcy 血症是近年来备受关注的心脑血管疾病危险因素，异常升高的Hcy 能够通过炎症反应、氧化应激反应参与心脑血管疾病的发生发展[6,7]。MTFFR 是Hcy 代谢过程中的关键酶，其活性下降会影响Hcy 代谢、增加Hcy 含量。关于MTFFR 活性调控机制的研究认为，MTFFR基因的多态性会影响编码产物的催化活性，其中第677 碱基C 向T突变的多态性已经在心肌梗死、颈动脉粥样硬化患者中被证实，发生该突变后会使MTFFR的耐热性和酶活性均减弱[8-10]。为了明确MTFFR基因多态性与缺血性脑卒中发生的关系，本研究首先对缺血性脑卒中患者MTFFR基因C677T 位点的基因型构成比和等位基因频率进行了分析。卒中组患者MTFFR基因纯合突变基因型TT的构成比及突变基因T的基因频率均明显升高，说明MTFFR基因C677T 位点C 向T的突变与缺血性脑卒中的发生有关。

MTFFR基因发生C677T 位点C 向T的突变后，编码产物催化Hcy 代谢的活性明显减弱，本研究对Hcy 含量的分析显示：卒中组中MTHFR基因TT基因型患者的血清Hcy 含量明显高于CT基因型、CC基因型患者，而CT基因型与CC基因型患者之间Hcy 含量无明显差异，说明MTFFR基因发生C677T 位点的纯合突变后会影响Hcy 代谢、增加Hcy 含量，而杂合突变并不影响Hcy 代谢、Hcy含量为发生明显变化。Hcy 具有促炎、促氧化的作用，通过刺激炎症反应、氧化应激反应的激活来参与动脉粥样硬化形成、粥样斑块稳定性下降等过程，进而引起心肌梗死、脑卒中等疾病的发生[11,12]。颈动脉是评价大动脉粥样硬化的窗口,颈动脉发生粥样硬化是脑卒中的危险因素之一,而颈动脉斑块稳定性的下降会直接增加斑块脱落并形成脑血栓的风险[13,14]；NSE和S100B 是神经元和神经胶质细胞内的标志物,能够在脑卒中病程中用于评价神经损伤的程度[15,16]。

本研究通过颈动脉超声来评价动脉粥样硬化的特征、通过血清NSE和S100B 含量的检测来评价神经损害的程度，卒中组中MTHFR基因TT基因型患者的血清NSE、S100B 含量及颈动脉易损斑块百分比明显高于CT基因型、CC基因型患者，而CT基因型与CC基因型患者之间清NSE、S100B含量及颈动脉易损斑块百分比无明显差异，说明MTFFR基因发生C677T 位点的纯合突变后会加重神经损害、影响斑块稳定性，而杂合突变不影响神经损害程度和斑块稳定性。在此基础上，本研究进一步进行了logistics 回归分析，旨在明确MTFFR基因多态性、Hcy 含量及颈动脉斑块类型在缺血性脑卒中发生和发展中的作用，结果显示：MTHFR基因C677T 纯合突变、高Hcy 血症、颈动脉易损斑块是脑卒中发生的独立危险因素。

综上所述，缺血性脑卒中患者存在显著的MTHFR基因多态性，表现为C677T 位点C 向T的突变；该多态性与缺血性脑卒中患者颈动脉斑块稳定性下降、神经损伤程度加重有关。