猪氨基肽酶N 作为受体介导猪冠状病毒感染的研究进展

韦欣欣，李泽辉，靳晓慧，魏战勇

（1.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450046；2.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450046）

冠状病毒（Coronavius，CoV）属于套式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、正冠状病毒亚 科（Orthocoronavirinae）、冠状病毒属（Coronavirus），为有囊膜的单股正链RNA 病毒。冠状病毒颗粒呈椭圆形、球形或轻度多形性，直径为60～200 nm，可在电镜下观察到棒状突起，形状与王冠相似[1]。冠状病毒根据其基因组差异分为α、β、γ 和δ 等4 个属，有着严格的宿主特异性，是感染各种动物和人类的重要传染病原，主要症状是引起感染的宿主呼吸道和胃肠道发生病变，少部分冠状病毒感染后还有可能会导致宿主肝脏和神经系统出现病变[2]。冠状病毒最早是从鸡的身上分离出来，以鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）为代表，到1965 年分离出第1 株人冠状病毒后，陆续发现7种可以感染人类的冠状病毒，其中3种为可引起人高致病性呼吸道感染的冠状病毒，分别为2003年广东省境内暴发的严重急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）、2012 年沙特阿拉伯暴发的中东呼吸综合征（Middle east respiratory syndrome，MERS）以及2019年湖北武汉暴发的2019 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎疫情（Coronavirus disease 2019，CoVID-19），对人类的生命健康造成了极其严重的威胁。这些急性致病性病原（SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2）的高致死率，再次引起了全世界对于冠状病毒的广泛关注，使科学家进一步认识到研究冠状病毒的重要性[3-4]。

除了感染人外，近年来冠状病毒在猪群中的感染流行也频发，如猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）[5]、猪呼吸道冠状病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）、2010 年由变异的强毒株引起的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）[6-10]、2014 年新发的 猪 δ 冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）、2017 年新发的猪肠道α冠状病毒（Swine enteric alphacoronavirus，SeACoV），这些猪肠道冠状病毒病的暴发，给我国养猪业造成了巨大的经济损失，每年因猪冠状病毒性腹泻病造成的养猪业损失高达300亿元[11]。

综述了猪氨基肽酶N（Porcine aminopeptidase N，pAPN）受体与不同猪冠状病毒受体结合域（RBD）结合机制方面的研究进展，分析不同猪冠状病毒在侵染宿主时与受体结合方式的异同，并对pAPN 受体抑制剂的相关研究进行探讨，为研究猪冠状病毒（SeCoVs）感染机制提供参考。

1 冠状病毒受体

绝大多数冠状病毒感染宿主的首个重要步骤是识别并结合宿主细胞表面受体从而启动入侵，通过宿主细胞的内吞作用等使病毒的基因组释放进入宿主细胞，进行复制和增殖[12]。冠状病毒表面存在一种向外突出的纤突（Spike，S）蛋白，对于冠状病毒颗粒与其宿主细胞内受体的结合和膜融合等过程有着重要的功能[13]。S 蛋白是Ⅰ型跨膜融合蛋白，分子质量较大，在病毒颗粒包装过程中会被蛋白水解酶切割为S1 和S2 两个亚单位。S1 包含有RBD，主要是负责病毒-宿主细胞间的识别和结合，S2 包含有融合肽（Fusion peptide，FP），主要在病毒-宿主细胞的膜融合过程中发挥功能[14]。冠状病毒S蛋白可直接影响病毒的毒力，所识别的受体种类及其在机体内的分布情况等也是确定冠状病毒宿主特异性和组织嗜性的关键因素之一[15]。

目前，已发现的冠状病毒受体主要有4种，分别是氨基肽酶N（Aminopeptidase N，APN）、血管紧张素转换酶 2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）、癌胚抗原相关细胞黏附分子1（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1）、二肽基肽酶-4（Dipeptidyl peptidas-4，DPP4）。其中，APN 属Ⅱ型糖蛋白，是一种锌金属蛋白酶，主要是Ⅰ型冠状病毒的黏附性受体，在小肠绒毛表面及呼吸道上皮细胞中大量表达[16-17]；ACE2 在肾素-血管紧张素系统的活动中扮演重要角色，能够水解血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），呼吸道上皮细胞表达的ACE2 蛋白是SARS-CoV 和SARS-CoV-2 感染细胞必不可少的[18-19]；CEACAM1 是Ig 超家族成员，广泛分布在胃肠道上皮细胞、小血管内皮细胞等，冠状病毒结合特异的受体CEACAM1 造成突起蛋白质构象改变，从而促进病毒与细胞的膜融合过程[20]；DPP4是Ⅱ型跨膜蛋白，在细胞表面以二聚体形式存在，可溶性DDP4 存在于循环系统，是MERS-CoV 感染细胞的功能性受体[21]。

2 猪氨基肽酶

pAPN 常大量表达于猪肠道上皮细胞和呼吸道上皮细胞[22-23]。冠状病毒通过其S 蛋白识别宿主pAPN中特异氨基酸感染宿主。pAPN编码963个氨基酸，可被胰蛋白酶分解为95 ku 的N 端和50 ku 的C 端两部分，有3 个抗原表位存在于剩余区域，pAPN 结合病毒的能力可能与其抗原中和区和受体结合区的位点突变有关[24]。pAPN 蛋白结构以及pAPN 抑制剂作用的结构区域如图1 所示[25]。真核表达系统、原核表达系统和杆状病毒-昆虫细胞系统是目前pAPN 的主要表达方式。越来越多的研究表明，pAPN 可能是多种猪冠状病毒侵入时的主要入侵受体[26-27]。

随pAPN 受体的广泛研究，pAPN 受体阻断药物也逐渐成为冠状病毒的研究热点之一。目前，已有部分pAPN 病毒结合位点得到鉴定，但具体的病毒结合区域仍有待阐明，抗pAPN 多克隆抗体、单链抗体和噬菌体展示等技术的使用更为防控TGEV、PEDV 提供了思路及方法。SHIRATO 等[28]制备的抗pAPN-C 片段的多克隆抗体可有效识别pAPN，同时运用噬菌体ELISA 技术制备的抗pAPN 单链抗体能够特异结合pAPN。WANG 等[29]体外表达pAPN 并免疫兔，获得高滴度pAPN 的免疫血清，通过这些抗体与pAPN 的中和反应来有效阻断TGEV 的感染。MENG 等[30]通过噬菌体展示技术设计出H、S 和F 等3 个合成肽，发现PEDV S 蛋白可与H 肽相互作用，从而来抑制病毒感染，为研究PEDV S 蛋白病毒与宿主细胞的结合和抑制位点提供了思路。

3 pAPN受体介导的猪冠状病毒感染

3.1 TGEV

TGEV 最早在1946 年被分离，其引起肠道感染的特点主要是剧烈呕吐、脱水和严重急性腹泻，尤其在出生不到14 d 的仔猪中有着极高的致死率[31]。DELMAS 等[16]采用TEGV 中和抗体方法研究发现，pAPN是TGEV 感染的主要功能性受体，同时明确指出TGEV 在pAPN 受体上的结合位点是第717—813 aa。GODET 等[32]通过TGEV S 蛋白不同酶切短体与pAPN 免疫共沉淀的方法，明确pAPN 与TGEV S 蛋白结合位点是Ser506 至Ile728，同时这也是S 蛋白的抗体黏附位点，能诱导产生中和抗体。

TGEV S 蛋白除了能与pAPN 结合，还可以与唾液酸相互结合，从而促进TGEV 的感染。研究表明，TGEV 感染缺失唾液酸的细胞时，病毒的感染性不会受到抑制，但会导致TGEV 结合细胞表面的能力下降6倍，表明S 蛋白与唾液酸的结合并不是TGEV感染所必需的，但唾液酸是TGEV 感染宿主的辅助结合因子[33]。SCHWEGMAN 等[34]研究发现，TGEV感染体外培养的细胞时，若吸附时间减少至5 min，用唾液酸水解酶对细胞进行预处理，则使TGEV 感染率降低80%，说明TGEV 的感染在吸附时间较短时有赖于唾液酸的结合。由此可见，唾液酸结合活性对TGEV 在小肠的不利环境中感染具有重要意义[35]。

3.2 PRCV

PRCV 与TGEV 有着较高的同源性，但对TGEV和PRCV 进行S 蛋白测序分析发现，两者存在有明显差异，PRCV S 蛋白在N 端有224 个氨基酸残基的缺失[36]，而TGEV S 蛋白与pAPN 结合位点未发现缺失。研究证明，PRCV 可利用pAPN作为入侵细胞的受体[37]。TGEV S 蛋白与唾液酸辅助因子结合的位置与PRCV 不同，这有可能是TGEV 与PRCV 组织嗜性存在差异的原因[38]。

PRCV 可在呼吸道中进行高度复制，在小肠和胃黏膜细胞中感染率极低，并不会导致胃肠疾病[39]。PRCV 感染只会引起短暂的咳嗽和呼吸困难，造成轻微和短暂的疾病，但其与其他病原体发生共感染会成为一个严峻的问题。

3.3 PEDV

近几年来，PEDV 疫情在亚洲暴发并持续流行[40]，对养猪养殖产业造成了巨大的经济损失，人们开始广泛开展PEDV 感染宿主细胞受体的相关研究。早期研究发现，Ⅰ型冠状病毒对于受体的选择高度保守，PEDV 作为Ⅰ型冠状病毒，可能与TGEV、FCoV 和HCoV-229E 一样，以pAPN 作为介导感染宿主的功能性受体[41]。LI 等[42]将pAPN 转染到对PEDV 不易感的 犬肾细胞 系MDCK细胞，pAPN 在MDCK 细胞中充分表达后，MDCK 细胞可被PEDV成功感染。单智夫[43]将pAPN 拆分为SPA、SPB 和SPC 3 个片段，分别转染至MDCK 细胞中，再对MDCK 细胞接种PEDV，发现转染SPC 片段的细胞出现病变，证明SPC 段存在pAPN 的受体功能域，即定位了与PEDV 感染有关的关键氨基酸区域是500—963位氨基酸。

目前，关于pAPN 能否作为PEDV 功能性受体存在着很大争议，非洲绿猴肾细胞（Vero）常常用来增殖PEDV，但并不能表达pAPN。而与此相反的是，猪睾丸细胞（ST）可表达pAPN，但PEDV 并不能在ST细胞中高效繁殖。NAM等[44]研究发现，细胞表面pAPN 受体的密度与PEDV 感染能力密切相关，提示ST 细胞表达pAPN 的量过低是其不能被PEDV有效感染的原因。

LIU 等[45]研究发现，PEDV 的S1 亚单位可 与pAPN 结合，而TGEV 与pAPN 结合力明显较低，提示可能有多种细胞表面蛋白质能够作为PEDV 的受体。DENG等[46]的研究结果表明，PEDV在Vero细胞中的感染不会因为pAPN 与短肽相互作用而受到抑制，可以认为其受体是另外一种与pAPN 差异较大的蛋白质。CHEN等[22]研究发现，PEDV不能感染ST细胞，表达pAPN 的人宫颈癌细胞（Hela-pAPN）以及CPK细胞也不能被PEDV有效感染。与此相反的是，TGEV 对于这3种细胞均可有效感染。由此表明，PEDV 的功能性受体并非pAPN。JI 等[47]通过研究PEDV 的S1 亚单位与pAPN 的结合机制发现，PEDV 与其他甲型冠状病毒如TGEV、PRCV、HCoV-229E 具有明显差异，以此来解释PEDV 不能感染ST细胞的原因。通过基因敲除技术发现，缺失pAPN的Vero 细胞仍然存在另一种受体介导PEDV 侵入[47]，缺失pAPN基因的猪不会感染TGEV，但仍会感染PEDV[48]。

大量研究结果表明，PEDV 有可能通过不同受体介导感染宿主细胞[47-49]，pAPN 作为PEDV 感染宿主的功能性受体尚未有定论，仍然需要更进一步的试验验证。PEDV 可以有效感染包括人、猴、猪以及蝙蝠在内的多个物种的细胞，说明PEDV 的受体很有可能是物种进化过程中较为保守的一类蛋白质。

3.4 PDCoV

PDCoV 是一类δ 型肠道冠状病毒，也是目前唯一被发现的可感染猪的丁型冠状病毒[49-50]。感染PDCoV 的猪通常会出现水样腹泻和呕吐症状，与感染TGEV 和PEDV 的猪有着相似的临床反应[51]。PDCoV S 蛋白S1 亚基有A、B、C 和D 等4 个结构域，A 结构域和B 结构域作为主要的蛋白质组成成分发挥结合功能，结构域C 和结构域D 主要发挥维持S1亚基整体结构的功能。PDCoV S1 亚基没有任何血凝活性，即不能结合唾液酸，A结构域被发现能够结合黏液素，但是目前并没有直接证据表明这种活性与PDCoV结合受体相关[52-53]。

SHANG 等[53]通过斑点杂交（Dot-blot）试验得出，结构域B 不能与pAPN 相互作用，说明可能存在其他细胞表面蛋白质来介导PDCoV 侵入宿主细胞。卢曼曼等[54]以TGEV 为指示病毒，通过入侵宿主细胞感染试验发现，在ST 细胞中过表达pAPN，对PDCoV 的增殖过程无明显影响；通过阻断试验发现，可溶性pAPN 并不能有效阻止PDCoV 感染ST 细胞。以上研究结果表明，pAPN 不是PDCoV 入侵宿主的受体，而且与PDCoV 增殖无关。为进一步筛选鉴定ST细胞表面的PDCoV受体分子，卢曼曼等[54]用PDCoV-S1 蛋白真核表达纯化系统，表达出最接近天然蛋白质构象的PDCoV-S1 蛋白，通过免疫共沉淀的方法筛选出可能的受体，并对筛选出的受体进行基因沉默和过表达发现，宿主热休克蛋白pHSPCB 在PDCoV 感染过程中起着重要作用。当pHSPCB 表达量高时，PDCoV 复制能够得到促进；表达量低时，PDCoV 复制被抑制。可见，pAPN 不是PDCoV 的受体分子，从而为PDCoV 的感染机制研究提供了新的研究思路。

与上述研究报道不同，刘炎等[55]分别利用纯化的PDCoV S1 蛋白和PDCoV 病毒，采用免疫印记、免疫荧光、免疫共沉淀、流式细胞技术等多种检测方法，对不同表达量的pAPN 和已经敲除pAPN的细胞进行结合感染介导试验，证明pAPN 能够介导PDCoV 感染宿主细胞。也有一些研究表明，过表达pAPN 能够促使非易感的BHK-21 细胞被PDCoV 感染，并且研究发现，敲除pAPN基因能够一定程度地抑制PDCoV的感染效果[27]。

TGEV 已被证明是利用pAPN 作为其功能性受体，唾液酸为其辅助因子。对于PEDV 来说，在其侵入过程中pAPN 的作用存在争议，因为唾液酸对不同的PEDV 毒株具有多种结合活性，唾液酸在PEDV 进入中的作用有待进一步阐明。PRCV 同样使用pAPN 作为功能性受体。PDCoV 是SECoVs 中唯一的δ 型冠状病毒，在感染过程中表现出巨大的种间差异（图2）[55]。

4 小结与展望

对于猪冠状病毒受体的研究主要包括猪冠状病毒受体的结构特征、生理功能，以及在病毒感染过程中与S 蛋白的相互作用等，研究这些为解释冠状病毒的致病机制和研发受体阻断药物提供了理论依据。目前，介导PEDV 和PDCoV 感染宿主的受体是否为pAPN 存在争议。此外，PEDV 感染Vero细胞的受体不同于感染猪肠道细胞的受体，宿主细胞生存的环境有无胰酶的存在也可能造成所用受体不一致。

猪冠状病毒的遗传物质为RNA，其进化变异速度较快，而其是否能够利用pAPN 之外的其他多种受体尚不清楚，揭示pAPN 受体及其他可能受体的结合机制，发现其与不同物种间传播的关系，可帮助预测猪冠状病毒的变异及其在新宿主中的暴发，对于研发抗病毒药物有重要意义。