非洲猪瘟病毒K145R 蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

耿笑林，孙杰，王彦伟，黄甜，刘鹏，曹红梅，逄文强，郝丽影，邓均华，黄玉欣，田克恭，

（1.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000；2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000；3.洛阳普泰生物技术有限公司，河南 洛阳 471000）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种猪、野猪等猪科动物的传染病[1-2]，软蜱是其传播的重要媒介之一[3]。由于目前尚无疫苗可用，该病自2018 年8 月首次传入我国以来[4-5]，给我国养猪业带来沉重打击。

ASFV 病毒粒子直径约为200 nm，由几个同心圆层组成，中心含有基因组的类核，由内向外被核心壳层、内囊膜、二十面体衣壳和外囊膜包围[6]。根据毒株的不同，双链DNA 基因组包含150～167 个开放阅读框[7]。通过对整个病毒基因组的测序和遗传分析，开放阅读框的功能包括病毒粒子结构蛋白和其他功能，涉及病毒毒力和/或宿主范围、RNA 转录和修饰、核苷酸甲基化、DNA 复制、蛋白质编码基因的预测和/或鉴定[8-11]。目前，已经发现了100多种不同的病毒编码或病毒诱导的感染细胞蛋白，以及50多种ASFV 颗粒的结构蛋白[12-14]。然而，许多蛋白质的功能和抗原特性仍然未知，严重阻碍了疫苗的开发。

在ASFV 感染的野猪肺细胞中，K145R 蛋白含量较高[15-16]；在2 个灵长类细胞系HEK-293 和Vero表达的ASFV 产物中，K145R 蛋白含量排在前5位[17]；对感染猪的转录组分析表明，K145R 在RNA水平上表达丰富[18]。以上结果表明，K145R 是一种重要的病毒蛋白，但目前对于K145R 蛋白的生物学功能完全未知。K145R 蛋白在哺乳动物细胞中大量表达，与病毒复制有关，针对K145R 蛋白的抗体可能有助于防止ASFV 感染。为了进一步了解K145R 蛋白的功能，通过大肠杆菌原核表达系统可溶性表达并纯化K145R 蛋白，对目的蛋白的大小及免疫反应性进行鉴定，制备单克隆抗体，并进行特异性、与病毒反应性等鉴定，旨在为K145R 蛋白的功能研究及亚单位疫苗、诊断试剂研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 大肠杆菌DH5α 和BL21(DE3)感受态细胞、质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；pET28a载体由国家兽用药品工程技术研究中心保存，引物及基因序列合成与测序，均由苏州金唯智生物科技有限公司完 成；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)高保真DNA 聚合酶，购自北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA 连接酶和限制性内切酶均购自赛默飞世尔科技公司；HRP 标记的羊抗猪IgG、HRP 标记的羊抗鼠IgG、FITC 标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的羊抗猪IgG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT，均购自Sigma 公司；ASFV 阳性血清、ASFV 抗原板，均购自欧洲非洲猪瘟参考实验室[Centro de Investigacin en Sanidad Animal(CISA-INIA)，Madrid，Spain]；小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定用ELISA试剂盒，购自洛阳佰奥通实验材料中心。

1.1.2 主要设备 IC222 EXCELLA 恒温培养箱购自德国Medcenter Einrichtungen 公司，E24R 恒温培养振荡器购自NBS 公司，6132核酸蛋白测定仪购自德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 重组蛋白K145R的原核表达及鉴定

1.2.1.1 重组表达质粒pET28a-K145R的构建根据GenBank 公布的ASFV SY18 株K145R 基因序列（GenBank 登录号：MH766894.1）设计PCR 引物，正向引物（K145R-F）序列：5′-GCCGGGCATATGTTCTCTAACAAAAAAT-3′（包含Nde Ⅰ酶切位点），反向引物（K145R-R）序列：5′-GGGCCGCTCGAGTTTAGAGC-3′（包含Xho Ⅰ酶切位点）。以合成的密码子优化后的K145R 基因序列为模板，使用引物组F/R 扩增目的基因片段，PCR 反应程序为95 ℃变性20 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共35 个循环。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收后，与pET28a载体一同由Nde Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶37 ℃酶切1 h，并进行纯化回收，回收产物与载体由T4 DNA连接酶室温连接1 h，然后转化DH5α 感受态细胞。挑取单菌落提取质粒后进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒即为pET28a-K145R。酶切验证正确后，进行测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，即为K145R蛋白的表达菌株。

1.2.1.2 重组K145R 蛋白的表达和纯化 将pET28a-K145R 质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至LB 培养基中培养过夜，取2 mL 培养过夜的菌种接种至含50 mg/L 卡那霉素的200 mL LB液体培养基中，于37 ℃、220 r/min振荡培养至OD600值达到0.8～1.0 时，温度降为28 ℃，并添加终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG 诱导目的蛋白表达，诱导时长为12 h（未诱导组不添加IPTG）。收集菌体沉淀，使用缓冲液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 值7.0）按1∶40 的体积比进行重悬，超声破碎，4 ℃、13 500 r/min条件下离心10 min，分离上清、沉淀（用原倍体积的上述缓冲液重悬），向摇瓶发酵所得菌体破碎上清加入0.01 mol/L 咪唑，经0.45 μm滤膜过滤后，采用Ni Sepharose 6 Fast Flow 蛋白质层析纯化系统进行蛋白质亲和层析纯化，收集洗脱产物，用SDS-PAGE检测蛋白质表达情况。

1.2.1.3 重组K145R 蛋白的Western blot 鉴定 重组K145R 蛋白纯化后与诱导组分离上清一同进行Western blot 鉴定，使用空载体（不含目的基因片段）转化BL21(DE3)的菌体破碎液作为阴性对照。Western blot 条件：电压25 V，电流2.5 mA，转膜时间10 min；分别以1 000 倍稀释的ASFV 阳性血清和阴性血清作为一抗，以2 000 倍稀释的HRP 标记的羊抗猪IgG作为二抗。

1.2.2 杂交瘤细胞株的建立 取4～6 周龄雌性BALB/c 小鼠，利用纯化的重组K145R 蛋白对其进行免疫，首次免疫按照1∶1（V/V）和弗氏完全佐剂充分乳化，第2、3 次免疫按照1∶1（V/V）和弗氏不完全佐剂充分乳化，免疫量均为0.1 mg/只，经背部皮下多点免疫，每14 d 免疫1 次，共免疫3 次。第3 次免疫后7 d 采集血清，利用K145R 蛋白建立的间接ELISA 方法检测免疫后小鼠血清中的抗体水平，对抗体效价最高的小鼠在细胞融合前3 d 进行加强免疫（0.2 mg/只，不加佐剂）。取其脾细胞，用常规PEG 融合法与SP2/0 细胞按10∶1 比例进行融合，以重组K145R 蛋白建立的间接ELISA 方法检测杂交瘤细胞上清，将阳性细胞孔连续进行亚克隆，直至克隆孔全部为阳性，扩大培养并冻存。

1.2.3 单克隆抗体腹水的制备 取8～10 周龄BALB/c 小鼠，每只腹腔注射0.5 mL 液体石蜡，于10 d后每只小鼠腹腔注射含量为30万个/mL的杂交瘤细胞0.5 mL，待小鼠腹部明显膨大后，抽取腹水，10 000 r/min离心10 min，收集上清，-70 ℃以下冻存备用。

1.2.4 单克隆抗体的鉴定

1.2.4.1 单克隆抗体效价测定 将腹水系列稀释后作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，用重组K145R 蛋白建立的间接ELISA 方法检测，检测结果为阳性的孔对应的最高稀释度为腹水的抗体效价。

1.2.4.2 单克隆抗体亚类检测 按小鼠单克隆抗体Ig 类/亚类/亚型鉴定用ELISA 试剂盒说明书进行检测。

1.2.4.3 单克隆抗体特异性检测 纯化的重组K145R 蛋白和空载体蛋白经SDS-PAGE 电泳后，转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，在封闭液中封闭2 h，加入1∶100 稀释的单克隆抗体，4 ℃过夜。再与HRP 标记的羊抗鼠IgG反应，加入DAB显色液后，观察结果。

1.2.4.4 单克隆抗体与ASFV 反应性 用商品化的ASFV抗原板，加入1∶100稀释的单克隆抗体作为一抗，同时设置PBS 和ASFV 阳性血清分别作为阴、阳性对照，37 ℃反应1 h，以FITC 标记的羊抗鼠IgG 或羊抗猪IgG 作为二抗，37 ℃反应40 min，用PBS 洗涤后置于荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒pET28a-K145R的构建

以合成的K145R 基因序列为模板，使用引物组K145R-F/R 对目的基因进行PCR 扩增，得到大小约450 bp的基因片段。使用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶同时对目的片段和pET28a载体进行双酶切，酶切产物连接后转化大肠杆菌DH5ɑ 感受态细胞。提取转化子质粒，并用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶进行双酶切鉴定，结果可得到pET28a 载体片段和目的基因K145R 片段（图1）。将酶切验证正确的重组表达载体pET28a-K145R进行测序，结果表明序列正确。

2.2 重组K145R蛋白的表达与纯化

SDS-PAGE结果表明，与未诱导组相比，诱导组上清中有明显的蛋白质条带，大小约为17 ku，与预测结果大小一致，而沉淀中较少，说明重组K145R蛋白以可溶性形式表达。纯化后可得到较为单一的目的蛋白条带，表明纯化所得目的蛋白纯度较高（图2）。

2.3 重组K145R蛋白Western blot鉴定

从图3 可以看出，诱导组菌体超声上清及重组K145R 蛋白纯化样品均可鉴定出大小约为17 ku 的条带。可见，重组K145R 蛋白可与ASFV 阳性血清产生特异性反应。

2.4 K145R蛋白单克隆抗体的制备

通过细胞融合、筛选及3 次亚克隆，获得1 株能够稳定分泌抗K145R 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1D4。通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株1D4，制备了小鼠腹水。

2.5 K145R蛋白单克隆抗体的鉴定

2.5.1 效价 利用重组K145R 蛋白建立间接ELISA 方法，测定制备的杂交瘤细胞株1D4 小鼠腹水的效价为1:5 120 000。

2.5.2 亚类 单克隆抗体1D4 的重链为IgG2a，轻链为κ。

2.5.3 特异性 从图4 可以看出，单克隆抗体1D4与ASFV 重组K145R 蛋白呈现出特异性显色反应，而与空载体蛋白无显色反应，表明单克隆抗体1D4能特异性识别重组K145R蛋白。

2.5.4 与ASFV 反应性 用ASFV 抗原板检测单克隆抗体1D4，单克隆抗体1D4 有黄绿色荧光（图5）。表明单克隆抗体1D4能与ASFV反应。

3 结论与讨论

表达ASFV 蛋白有助于ASFV 亚单位疫苗的研究及诊断试剂开发，其中对部分蛋白质已进行表达和研究[19-21]，但有关K145R 蛋白研究较少。K145R蛋白在病毒复制周期的后期表达丰富，没有被整合到ASFV 颗粒中，对ASFV 的体外繁殖不是必需的，但大量存在于细胞质中，且均匀分布[22]，说明K145R蛋白可能在病毒的感染过程中具有重要的功能。

通过对经典毒株BA71 和无致病性毒株BA71V的基因组序列对比分析发现，K145R 蛋白与多基因家族MGF505 同源性高[23]，可能与蛋白质的免疫逃避系统有关。由于BA71V 缺失K145R 基因，K145R蛋白可能是ASFV 相关的毒力蛋白。此外，K145R蛋白也应用于ASFV 的系统发育树构建和追踪病毒传播起源研究[24]。由于有关K145R 蛋白研究较少，潜在的功能未知，针对K145R 蛋白的外源表达和抗体制备，可为其功能研究和ASFV诊断奠定基础。

本研究构建了K145R 蛋白的重组表达载体pET28a-K145R，诱导表达结果显示，表达的重组K145R 蛋白主要以可溶性形式存在，大小约为17 ku。Western blot 分析证实，重组K145R 蛋白具有良好的反应原性。以纯化的重组K145R 蛋白为免疫原，获得单克隆抗体1D4，其ELISA效价可达1∶5 120 000，能特异性识别重组K145R 蛋白，且可与ASFV 反应。本研究获得的重组K145R 蛋白及其抗体可应用于K145R 蛋白的功能研究，并有望用于ASFV亚单位疫苗的研究及诊断试剂开发。

综上，本研究成功构建了原核表达载体pET28a-K145R，并得到了约为17 ku 的可溶性重组K145R 蛋白，利用表达的重组蛋白制备了能特异性识别重组K145R 蛋白、且能与ASFV 反应的单克隆抗体，为后续ASFV 蛋白功能研究及诊断试剂开发奠定了基础。