固本抑瘤Ⅱ号抑制Hep-2荷瘤小鼠喉癌发生的机制研究

白云飞，崔晓波，王博谦，王亚平，杨莉娜，刘佳荣，覃 洁

喉癌起源于喉黏膜上皮，是头颈部主要恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的1%～5%[1]，且病死率高[2]。目前，喉癌治疗方法以外科手术、放疗、化疗或联合治疗为主，但通常会发生较严重的不良反应，严重影响新患者的治疗和预后[3]。因此，迫切需要研发新的有效治疗药物。固本抑瘤Ⅱ号(GYⅡ)是由多名著名中医在经方基础上结合临床实践经验研制的具有益气、活血、解毒作用的综合方剂。多项临床试验已证实，GYⅡ具有良好的抗肿瘤作用，可有效缓解化疗的毒副作用，减轻化疗引起的气虚血瘀证状[4-5]。但目前尚无GYⅡ在喉癌中应用的报道。近年来ERK和Akt信号通路已被确定为肿瘤治疗的潜在靶点，最新研究表明，在小鼠乳腺癌模型中，GYⅡ可通过抑制ERK和Akt信号通路激活，抑制肿瘤的生长和转移[6-7]。因此，本研究构建Hep-2荷瘤小鼠，探究GYⅡ的抗肿瘤作用，以及其是否通过作用于ERK和Akt信号通路而发挥生物学功能的。

1 材料与方法

1.1实验动物 6周龄雌性裸鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。在22℃、湿度55%、12 h/12 h明暗光照循环条件下饲养。

1.2主要试剂

1.2.1GYⅡ制备方法：GYⅡ由北京中医院提供，由党参、茯苓、苍术、黄芪、川芎、白术等13味中药组成，按照《中国药典(2010)》规程和《药品生产质量管理规范》生产，经石油醚脱脂，水提醇沉和去蛋白程序获得。临用前，用0.9%氯化钠注射液溶解至0.05和0.10 mg/ml[8]。

1.2.2检测试剂：RPMI 1640培养液、胎牛血清(FBS)和双抗购自Gibco公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海锐赛生物技术有限公司；蛋白免疫印迹使用的一抗anti-β-actin(1︰1000)购自Santa Cruz公司，anti-ERK1/2(1︰500)、anti-ERK1/2(1︰1000)、Akt(1︰1000)和p-Akt(1︰500)均购自CST公司；小鼠肿瘤组织解离液购自美天旎生物技术公司；TUNEL凋亡检测试剂盒及4%多聚甲醛固定液购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2.3实验仪器：流式细胞仪(FACS Calibur，BD公司)，轮转式切片机(HistoCore MULTICUT，徕卡公司)，CO2培养箱(4111，Thermo公司)，数显游标卡尺(0～150 mm，Mitutoyo公司)，全自动组织处理器(gentleMACS，美天旎生物技术公司)，显微镜(BX51，奥林巴斯株式会社)。

1.3研究方法

1.3.1Hep-2细胞培养：Hep-2细胞系从中国典型培养物保藏中心购买，并于本实验室传代、保存。用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养，培养条件为37℃、5% CO2，当细胞汇集率达90%时传代。

1.3.2Hep-2荷瘤小鼠模型的构建：将对数生长期Hep-2细胞制成无血清细胞悬液，接种于裸鼠背部，每只接种100 μl，含有2×106细胞，待瘤体直径约50 mm3时，采用随机数字表法将模型小鼠分为模型组、GYⅡ 2.5 g/kg组和GYⅡ 5.0 g/kg组，每组5只，GYⅡ不同剂量组灌胃法给药，每日1次，持续30 d，模型组替换为生理盐水。每3天测量肿瘤体积1次。肿瘤体积=1/2×a(长径)×b(短径)2[7]。

1.3.3肿瘤单细胞悬液制备：实验终点，剪开小鼠背部皮肤，钝性分离取出肿瘤，将肿瘤置于预冷的RPMI 1640培养液中。配制小鼠肿瘤解离液，按照Gentle MACS肿瘤解离器使用说明解离肿瘤，经70 μm细胞筛过滤获得单细胞悬液。

1.3.4Annexin-V和PI流式细胞凋亡检测：上述获得的细胞悬液用PBS液洗涤2次，收集细胞加入200 μl Binding Buffer、10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI后混合，避光条件下孵育30 min，缓慢加入PBS液400 μl，防止剧烈操作导致细胞破裂，随后立即用流式细胞仪进行检测。

1.3.5TUNEL凋亡染色：使用TUNEL凋亡检测试剂盒检测肿瘤组织中凋亡细胞数量，肿瘤组织经冰冻切片，切片厚10 μm，浸入4%多聚甲醛15 min后，PBS液充分清洗3次，每次15 min。后行TUNEL染色，主要步骤：按照使用说明配制TUNEL反应液；取反应液50 μl加至预处理好的切片组织正中，室温静置孵育1 h；DAB染色，置于光镜下，随时观察以控制染色时间；苏木精复染，时间2～3 min，染色完成后蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明组织，封片。凋亡细胞计数方法：置于OLYMPUS普通光学显微镜下，随机选取5个视野，通过划“正”字法计数TUNEL阳性细胞，5个视野细胞数量求和作为总数，最终统计数量以总数/5±标准差表示。

1.3.6Western blot法测定ERK和Akt蛋白磷酸化表达：研钵预冷状态下加入瘤组织，快速研磨成粉末状后立即加入同等适量RIPA裂解液，充分混匀提取总蛋白并采用BCA法定量，将等量蛋白提取液(蛋白量约45 μg)用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；40 V电压下转膜1 h至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；将PVDF在4.5%脱脂牛奶缓冲液中室温封闭1 h；清洗后按比例加入相应一抗，4℃静置过夜；TBST缓冲液清洗3次，每次15 min；加入对应二抗，注意二抗需与显色方式相对应，然后室温孵育1 h；显影并拍摄，Image J软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1肿瘤生长情况 模型组小鼠瘤体持续生长，至处理第30天，瘤体达(1387±232)mm3；GYⅡ灌胃给药第12天，肿瘤体积逐渐小于模型组，至第30天，GYⅡ 2.5 g/kg组肿瘤体积为(765±152)mm3，GYⅡ 5.0 g/kg组肿瘤体积为(440±98)mm3。见图1。至实验终点，GYⅡ 2.5 g/kg组和GYⅡ 5.0 g/kg组肿瘤体积均小于模型组，GYⅡ 5.0 g/kg组肿瘤体积小于GYⅡ 2.5 g/kg组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图1 Hep-2荷瘤小鼠肿瘤生长曲线GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号

图2 实验终点各组Hep-2荷瘤小鼠肿瘤体积比较GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号；与模型组比较，aP<0.01；与GYⅡ 2.5 g/kg组比较，bP<0.01

2.2肿瘤细胞凋亡情况 模型组肿瘤细胞凋亡率为(6.2±1.2)%，GYⅡ 2.5 g/kg组肿瘤细胞凋亡率为(15.8±4.3)%，GYⅡ 5.0 g/kg组肿瘤细胞凋亡率为(36.5±5.2)%。GYⅡ 2.5 g/kg组和GYⅡ 5.0 g/kg组肿瘤细胞凋亡率均高于模型组，GYⅡ 5.0 g/kg组高于GYⅡ 2.5 g/kg组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3、4。TUNEL凋亡染色结果所示，模型组TUNEL阳性细胞数量为(23±4)个，GYⅡ 2.5 g/kg组为(68±15)个，GYⅡ 5.0 g/kg组为(147±36)个。GYⅡ 2.5 g/kg组和GYⅡ 5.0 g/kg组肿瘤凋亡细胞数量均高于模型组，GYⅡ 5.0 g/kg组高于GYⅡ 2.5 g/kg组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5、图6。

图3 流式细胞术检测各组Hep-2荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡率GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号

图4 各组Hep-2荷瘤小鼠细胞凋亡率比较GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号；与模型组比较，aP<0.01；与GYⅡ 2.5 g/kg组比较，bP<0.01

图5 各组Hep-2荷瘤小鼠TUNEL凋亡染色图片(100×)GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号

图6 各组Hep-2荷瘤小鼠TUNEL阳性细胞数量比较GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号；与模型组比较，aP<0.01；与GYⅡ 2.5 g/kg组比较，bP<0.01

2.3GYⅡ对ERK和Akt信号通路的影响 GYⅡ 2.5 g/kg组和GYⅡ 5.0 g/kg组肿瘤组织中p-ERK和p-Akt蛋白表达量较模型组低，且GYⅡ 5.0 g/kg组低于GYⅡ 2.5 g/kg组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图7、图8。

图7 各组Hep-2荷瘤小鼠ERK和Akt相关蛋白表达情况GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号

图8 各组Hep-2荷瘤小鼠p-ERK和p-Akt蛋白表达量GYⅡ为固本抑瘤Ⅱ号；与模型组比较，aP<0.01；与GYⅡ 2.5 g/kg组比较，bP<0.01

3 讨论

喉癌是头颈部第二常见恶性肿瘤[2]，传统治疗方法均可导致不同程度的不良反应，如免疫抑制、营养代谢紊乱等[9-14]。因此，研发新的有效的喉癌治疗药物势在必行。中药已有数千年的实践历史，目前已被广泛应用于肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌等多种癌症的治疗[15-16]，具有抗药性低、毒副作用小等优点[17-22]。GYⅡ是根据益气、活血化瘀、解毒散结理论研制的由13种不同中草药组成的综合方剂[7]，可与化疗和放疗协同作用提高癌症的治疗效果，延长患者生存期，改善患者预后[4]。在Lewis肺癌移植瘤小鼠中，GYⅡ可诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤生长[23]。最新研究发现，在小鼠乳腺癌模型中，GYⅡ可抑制肿瘤生长和转移，作用机制与抑制ERK和Akt信号通路有关[7]。但目前关于GYⅡ在喉癌中治疗效果的报告较少。本研究证实，在Hep-2荷瘤模型鼠中，不同剂量GYⅡ处理均能够抑制肿瘤细胞生长，肿瘤体积显著小于模型组，且能加速肿瘤细胞凋亡。

Akt和ERK信号通路在癌症患者体内异常激活，既往一直是癌症治疗的靶点。Akt信号通路参与肿瘤细胞生长、增殖、存活、迁移和侵袭的调节；ERK信号通路是重要的促有丝分裂信号通路[6,24]。Akt和ERK信号通路能够抑制肿瘤细胞凋亡，相反通过基因敲除技术或靶向药物抑制Akt和ERK信号通路活性则可抑制肿瘤进展。在下咽部鳞状细胞癌患者中，GDC-0980处理能够明显降低FaDu细胞中Akt和ERK磷酸化水平，将癌细胞阻滞于G1期，抑制肿瘤细胞增殖[25]。TBX1因子失活可降低甲状腺癌细胞PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路活性，延缓疾病进展[26]。但目前关于GYⅡ对喉癌细胞Akt和ERK信号通路影响的研究较少。本研究结果显示，在Hep-2荷瘤小鼠中，GYⅡ可显著降低ERK和Akt蛋白磷酸化水平，抑制ERK和Akt信号通路活性，加速肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，且与GYⅡ剂量呈正相关。但是，肿瘤进展涉及到多种信号通路，并且ERK和Akt信号通路除了具有抗凋亡、促增殖作用外，还具有调节血管生成等作用，因此GYⅡ对喉癌的抑制作用还有待更深入的研究[27-28]。

综上，在Hep-2异种移植模型小鼠中，GYⅡ通过抑制ERK和Akt信号通路活性，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，GYⅡ有望成为喉癌患者有效的辅助治疗方剂。本研究进一步拓展了GYⅡ治疗的肿瘤类型，为其临床应用奠定了基础。